選擇性凋亡DNA LADDER抽提試劑盒的應用
一、背景
選擇性凋亡DNA LADDER抽提試劑盒選擇性從組織和細胞中分離提取凋亡DNA ladder，通過選擇性分離基因組DNA與凋亡DNA ladder，最大限度的減少了基因組DNA對凋亡DNA ladder的觀察干擾，因此顯著提高了檢測敏感度。反應可在微量離心管進行，2.5小時完成，快速方便；無需有機抽提，檢測靈敏度J高，可從約2000個凋亡細胞中檢測到DNA ladder。推薦起始細胞量為5-10x105個，但投入的細胞量可在1x105~5 x106之間變化。
原則是總細胞中應含有至少約1-2x104個凋亡細胞。多于2x104個凋亡細胞通常可獲得十分清晰的凋亡DNA ladder。本試劑盒也可用于從組織中提取凋亡DNA ladder。但與培養細胞相比，整體動物組織凋亡細胞出現的時間、部位、程度等規律性差往往造成難以準確取材，可能顯著影響實驗結果。
凋亡(apoptosis)或程序性死亡的細胞一個形態學的顯著特點是染色體DNA以核小體為單位（185bp）規律斷裂形成長度約為n x 185bp(n=1,2,3,4...）的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳顯示為階梯狀凋亡DNA Ladder，是凋亡細胞最直觀的特征。
細胞凋亡(Apoptosis)是生物體發育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細胞主動有序的死亡方式。當細胞遇到內、外環境因子刺激時，啟動基因調控的自殺保護措施，去除體內非必需細胞或即將發生特化的細胞。在這一過程中，細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細胞或鄰近細胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細胞自主死亡，包含一系列信號事件組成的通路。
細胞凋亡失調與多種疾病有關，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。
細胞凋亡通過特征性的形態學和生物化學變化而區別于壞死(Necrosis)，包括細胞皺縮、細胞核皺縮、核膜核仁破碎等等。在正常活細胞中，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)位于細胞膜的近細胞質面。而在凋亡細胞中，PS從質膜的內部外翻到細胞表面即細胞膜外側，從而使PS暴露于細胞外部。在白細胞的凋亡過程中，白細胞表面的PS標記可以被巨噬細胞識別，從而最終被巨噬細胞吞噬。
二、應用
用于Rbm14在小鼠早期胚胎發育過程中的功能研究：
選擇性剪接是由反式作用RNA結合蛋白結合到mRNA前體轉錄本的順式作用元件上調控的。剪接小體作為介導mRNA前體剪接的核心反式作用元件,由5個小核RNAs和多種RNA結合蛋白因子組成的。除了剪接小體,其他輔助性RNA結合蛋白,尤其是RNA識別基序（RNA Recognition Motif,RRM）,也參與了時空特異性選擇性剪接事件的調控。RBM14是一種RNA結合蛋白,參與多種細胞功能和生物過程,比如轉錄共激活、紡錘體組裝、病毒感染和干細胞分化等。
最近研究也報道了RBM14在小鼠胚胎干細胞（mouse Embryonic Stem Cells,mESCs）的多能性維持和中胚層分化中發揮重要作用。然而,RBM14在哺乳動物胚胎發育中的體內功能還不清楚。在成簇規律間隔的短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9）和胚胎顯微注射技術的介導下,我們得到了Rbm14單等位基因敲除小鼠,并將其雌雄小鼠進行交配。結果發現,Rbm14雙等位基因敲除會導致小鼠胚胎致死。
進一步的組織學分析表明,Rbm14敲除會導致上胚層細胞凋亡和mESCs細胞凋亡,以致小鼠胚胎發育阻滯在原腸胚階段。機制研究發現,RBM14參與DNA損傷應答相關基因的選擇性剪接,敲除RBM14會導致這些基因發生異常的選擇性剪接,并造成mESCs中DNA損傷的積累。因此,研究發現,在小鼠早期胚胎發育過程中,RBM14通過調控與DDR相關基因的選擇性剪接,在維持基因組DNA完整性中發揮了關鍵性作用。
研究中的關鍵新發現包括：（1）Rbm14雙等位基因敲除,造成小鼠早期胚胎致死。（2）Rbm14雙等位基因敲除后,引起著床后胚胎上胚層細胞周期阻滯和細胞凋亡,導致早期胚胎發育中原腸運動紊亂。（3）Rbm14敲除,導致在mESCs中DNA損傷的積累。（4）RBM14與可變剪接因子相互作用,通過選擇性剪接調控DDR相關基因。
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