人過氧化氫酶(CAT)ELISA KIT的應用
一、背景
人過氧化氫酶(CAT)ELISA KIT運用雙抗體夾心ELISA酶聯免疫法定量測定血清、血漿或其它相關生物液體樣本中過氧化氫酶(CAT)的含量。
二、檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人過氧化氫酶（CAT）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人過氧化氫酶（CAT）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
三、樣品收集、處理及保存方法
1、血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3、細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。
四、檢測程序
1、加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2、洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3、每孔中加入第一抗體工作液10 0ul。將反應板充分混勻后置37℃6 0分鐘。
4、洗板：同前。
5、每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃3 0分鐘。
6、洗板：同前。
7、每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應15分鐘。
8、每孔加入100ul終止液混勻。
9、30分鐘內用酶標儀在45 0 nm處測吸光值。
五、結果計算與判斷
1、所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2、以標準品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3、根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應CAT含量，再乘上稀釋倍數即可。
六、應用
用于人過氧化氫酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達研究：
生物體在新陳代謝中,細胞有氧呼吸所消耗的O2約10%被還原成H2O2。后者很容易被細胞中各種還原劑還原成·OH和OH-,而·OH是極毒的羥自由基,能氧化與它接觸的幾乎所有細胞組份,引起衰老、癌變及其它病癥。生物體內存在的過氧化氫酶（catalase,CAT）能有效地催化細胞中產生的高濃度H2O2（2H2O2→O2+2H2O）,從而防止自由基對細胞的損傷。此外,CAT具有重要的工業應用價值。目前商品化的過氧化氫酶主要來源于牛肝、微球菌和黑曲霉,主要用于工業生產。對于醫藥和保健來說,人源的CAT應用價值更高。
利用基因重組技術實現人CAT基因在大腸桿菌中實現了有生物活性的表達,為其開發利用奠定了基礎。本實驗使用人cDNA文庫,利用嵌套式PCR技術,獲得了編碼人CAT基因完整讀碼框的cDNA序列,選用pMAL-c2x、pBV221質粒作為載體,經過定向克隆將人CAT基因分別構建了融合pMAL-c2x-CAT和非融合表達載體pBV-CAT,并轉化到大腸桿菌TB1和JM109中實現表達。
在融合表達中,分別選擇了37℃、28℃、20℃作為不同誘導溫度對pMAL-c2x-CAT重組菌進行誘導表達。隨著溫度的降低,可溶性目的蛋白的表達量逐步增加,12h誘導后表達產物可占總菌蛋白的23%。該表達產物（MBP-CAT）經親和層析純化后并未表現出CAT活性。
用Factor Xa將MBP蛋白切掉后,產物明顯具有CAT活性,說明MBP蛋白的存在可能影響了CAT蛋白的正確折疊,從而影響了它的酶學活性。而在pBV221-CAT非融合表達體系中,經溫度誘導后,目的蛋白不僅呈可溶性,且具有CAT活性,但表達量較低。
在目的蛋白的活性測定中,采用了KMnO4染色法和紫外分光光度法進行活性測定。KMnO4染色法方法簡便直觀,易操作,特異性好,但不適用于活性定量測定；而紫外分光光度法檢測速率快,靈敏度高,操作簡便,適于過氧化氫酶活性的快速定量測定。還對重組酶的性質進行了研究（酶的熱穩定性、pH穩定性）,為以后重組人過氧化氫酶的進一步開發利用及生產、醫藥等方面的應用奠定了基礎。
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