糞便基因組DNA快速提取試劑盒的應用
一、背景
糞便基因組DNA快速提取試劑盒適用于從糞便樣本中提取總DNA，包括細胞、細菌、寄生蟲以及病毒DNA，也適用于含有高濃度PCR反應抑制劑的樣本。本品可處理多至300 mg的糞便樣本，純化獲得主要為20-30 kb的DNA片段，純化過程中不需苯酚或氯仿等有毒溶劑，無需乙醇沉淀，可在一小時內獲得高純度的DNA。
本試劑盒采用獨特的緩沖系統使裂解液中的DNA高效結合到吸附柱上，同時糞便中的蛋白雜質及抑制下游反應的其他有機化合物可流過膜，PCR和酶反應的抑制劑以及殘留的雜質可通過兩步洗滌步驟有效去除，最后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可獲得高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫構建、Southern Blot、分子標記等下游實驗。
二、操作步驟
1、準備工作:取TE buffer,加至蛋白酶K中,充分混勻,配制成20mg/ml的白酶K溶液,可分裝成小份,20保存1年有效。
2、取菌液置于EP管中,離心,棄上清液。再次加入1.5m菌液,重復該步驟一次。
3、加入Eco裂解液和3μl白酶K溶液(20mg/ml),充分混勻,37℃孵育1h。
4、加入CTAB沉淀液,充分混勻,65℃孵育10min
5、加入780蛋白清除液,充分混勻,12000g離心5~10min
6、轉移上清至新EP管中,加入2倍體積的Eco漂洗液,混勻,20℃放置30min或過夜。
7、13000g離心10min,棄上清液,加入70%乙醇洗滌沉淀
8、13000g離心10min,棄上清液,室溫干燥DNA沉淀,加入100或適量TE buffer溶解沉淀,20℃保存。TE buffer體積越大,DNA濃度越低。
三、應用
用于基于LFD-RPA的主要腸道血吸蟲核酸快速可視化檢測方法的建立及初步評價研究：
結合側流層析試紙條（Lateral flow dipstick,LFD）和重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能簡單、快速識別日本血吸蟲、曼氏血吸蟲核酸的可視化檢測技術,初步評價其對血吸蟲中間宿主或終宿主感染早期的檢測價值,并通過試劑、時間的折算,分析成本投入情況。
方法：以日本血吸蟲SjR2和SjG55A作為靶基因,結合Primer Premier 5軟件及手工輔助設計引物,通過簡易檢出限、特異性確定引物序列,初步建立RPA檢測方法。以RPA檢測為基礎,設計探針,確定最佳反應條件,初步建立LFD-RPA檢測方法。以PCR方法為平行對照,評價建立檢測方法的最低檢出限、敏感性、特異性及不同終止方式檢測結果。
制備不同比例混合的陽性釘螺和陰性釘螺基因組,評價LFD-RPA方法的最低檢出混合度。分別取毛蚴感染后不同時期釘螺樣本,用解剖鏡檢法判斷釘螺感染情況,提取釘螺樣本DNA,評價LFD-RPA方法對釘螺不同感染階段的血吸蟲核酸檢測能力,進行RPA、PCR的平行檢測。
LFD-RPA方法檢測現場采集的釘螺樣本,RPA、PCR為平行對照,評價LFD-RPA方法的檢測效果。以曼氏血吸蟲SmCOX1為靶基因,結合Primer Premier 5軟件、手工輔助設計篩選引物,確定最終引物序列,初步建立RPA檢測方法。以RPA檢測為基礎,設計探針,確定最佳反應條件,初步建立LFD-RPA檢測方法。
以文獻中針對曼氏血吸蟲Sm1-7基因設計的引物為基礎,設計特異性探針,探索最佳反應溫度及時間,建立LFD-RPA檢測方法。以PCR為平行對照,評價建立方法的最低檢出限及與特異性。建立40尾、80尾曼氏血吸蟲尾蚴梯度感染小鼠的動物模型（簡稱“40尾組”、“80尾組”）,并于感染后不同時間收集小鼠糞便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法進行平行檢測,全面評價LFD-RPA方法檢測曼氏血吸蟲早期感染的效能。
隨后,收集本實驗室常用的血吸蟲核酸檢測生物學技術的基礎數據,包括需要的試劑盒或主要試劑的具體名稱、單盒價格、單盒反應次數以及來源。計算不同檢測方法的每個樣本投入成本,包括每個樣本檢測所需的試劑成本、勞動力成本。以每個樣本投入試劑成本、勞動力成本為基礎,在設置陰參、陽參的單個樣本檢測情況下,計算每次檢測投入試劑成本、勞動力成本。同時,將96個反應作為不同檢測方法批量檢測總量。
計算批量檢測情況下,每個樣本檢測投入試劑成本、勞動力成本。并按照實驗所需儀器數量將每種方法的技術要求劃分為簡單、一般、復雜、極復雜四個等級,對LFD-RPA和其他核酸檢測方法的成本和技術要求進行比較分析。
結果：成功建立了以日本血吸蟲SjR2、SjG55A為靶基因的LFD-RPA檢測方法以及以曼氏血吸蟲SmCOX1、Sm1-7為靶基因的LFD-RPA檢測方法,各方法的最優反應參數均為39℃、20min。冰上靜置、滴加DNA提取液或酚氯仿三種終止LFD-RPA反應的方式對檢測結果無影響。
以SjR2、SjG55A為靶基因建立的LFD-RPA方法對含有日本血吸蟲靶基因的質粒和成蟲基因組最低檢出限分別為1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,優于對應RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法與曼氏血吸蟲、陽性雙臍螺、埃及血吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、衛氏并殖吸蟲基因組DNA均無交叉反應。
SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、衛氏并殖吸蟲基因組DNA無交叉反應,但可檢出曼氏血吸蟲、陽性雙臍螺,提示與曼氏血吸蟲有交叉反應。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分別能最低檢出2000只、1500只陰性釘螺中的1只陽性釘螺,最低檢出混合度均高于對應RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可檢出20組1:50的混合陽性釘螺,3中方法的敏感性均為100%。
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