超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定
實(shí)驗(yàn)原理
SOD是含金屬輔基的酶，它催化以下反應(yīng)：02 - +02 - + 2H+ H2 02 +02
由于超氧陰離子自由基02 - 壽命短，不穩(wěn)定，不易直接測(cè)定SOD活性,而采用間接的方法。
目前常用的方法有3種, 包括氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法，鄰苯三酚自氧化法，化學(xué)發(fā)光法。
本實(shí)驗(yàn)主要介紹光化還原法，其原理是：氮藍(lán)四唑在蛋氨酸和核黃素存在條件下，照光后發(fā)生光化還原反應(yīng)而生成藍(lán)色甲腙，藍(lán)色甲腙在560nm處有最大光吸收.。
SOD能抑制NBT的光化還原，其抑制強(qiáng)度與酶活性在一定范圍內(nèi)成正比。
試劑:
1.50m mol/l pH7.8的磷酸緩沖液(PBS) 。含0.1m mol/l EDTA
2.220m mol/l甲硫氨酸：稱3.2824g甲硫氨酸\,用50m mol/l pH7.8的磷酸緩沖液定溶至100ml（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）溶液（現(xiàn)配）：稱NBT 0.102g,用
50m mol/l pH7.8的磷酸緩沖液(PBS)溶解定容至100ml.
4.0.033m mol/l核黃素：稱2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。
實(shí)驗(yàn)步驟
1．酶液制備
稱取植物組織0.5g先加入2.5ml PBS，研磨勻漿后，再加入2.5ml PBS混勻，
4℃下 10000r/min離心15min 上清液即為粗酶液。取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。
2.酶活性測(cè)定
取10ml小燒杯7只, 3只測(cè)定樣品,4只作為對(duì)照，
按下表加入試計(jì):
試劑 | 用量(ml ) | 終濃度(比色時(shí)) |
50m mol/l (PBS) 220m mol/l Met 1.25m mol/l NBT 0.033m mol/l核黃素 酶液 總體積 | 4.05 0.3 0.3 0.3 0.05 5.0 | 13m mol/l 75μ mol/l 2.0μ mol/l 對(duì)照以緩沖液代替酶液 |
將上述試劑混勻后，1只對(duì)照燒杯至于暗處，另3只對(duì)照燒杯和樣品一起置于
4000lx日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光一致，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)）。
最后在560nm處測(cè)定反應(yīng)液的光密度。以不照光的對(duì)照燒杯作參比，分別測(cè)定其
他各管的光密度。
3.蛋白含量的測(cè)定
步驟1的上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用考馬斯亮藍(lán) G-250法測(cè)定蛋白含量.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算
SOD活性單位是以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示。可按下式計(jì)
算SOD活性：
SOD總活性=SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)總濃度
式中: SOD總活性以 U/gFW,比活力單位以 U/mg蛋白表示 ACK為對(duì)照杯(光照)的光吸收值;AE為樣品的光吸收值;V為樣液總體積,V1為測(cè)定時(shí)樣品用量,W為樣重g.
過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定
實(shí)驗(yàn)原理
植物體內(nèi)的黃素氧化酶類代謝產(chǎn)物常包含H2 02 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H2 02 的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用。過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是清除 H2 02 的重要保護(hù)酶，能將H2 02 分解為02 和H2 0, 從而使機(jī)體免受H2 02 的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。
(CAT)催化如下反應(yīng)：
2 H2 02 →2 H2 0 + 02
本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定H2 02 的減少量來測(cè)定CAT的活性。
在H2 02 存在條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚。可用分光光度計(jì)測(cè)生成物的含量來測(cè)定活性。
試劑藥品
1.50m mol/l pH7.0的磷酸緩沖液
2.0.3% H2 02: 吸0.5ml 30% H2 02 加入pH7.0的磷酸緩沖液至 50ml
3.0.2% 愈創(chuàng)木酚 :秤0.2g愈創(chuàng)木酚加入pH7.0的磷酸緩沖液至 100ml
實(shí)驗(yàn)步驟
酶液的制備
1.稱取葉片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min
離心15min取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。
2. CAT 活性的測(cè)定
在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H2 02 1ml, H2 0 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液
啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)240nm處的OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個(gè)活力單位。
3. POD 活性的測(cè)定
在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H2 02 1ml, .0.2% 愈創(chuàng)木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄470nm處OD增加速度。將每分鐘OD增加0.01定義為1個(gè)活力單位。
4. 用考馬斯亮藍(lán) G-250法測(cè)定蛋白含量.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算
CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。
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