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EB(Ethidium bromide,溴化乙錠)
發布日期:2022-06-29 21:09:35


EB(Ethidium bromide,溴化乙錠)


溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑,用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠用標準302nm 紫外光透射儀激發并放射出橙紅色信號,可用Polaroid 底片或帶CCD 成像頭的凝膠成像處理系統拍攝。


  觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色,溴化乙錠含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環平面基團。它與DNA的結合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中,大約每2.5個堿基插入一個溴化乙錠分子。


當染料分子插入后,其平面基團與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近,導致與DNA結合的染料呈現熒光,其熒光產率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料,而被結合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。


這兩種情況下,被吸收的能量在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。由于溴化乙錠-DNA復合物的熒光產率比沒有結合DNA的染料高出20-30倍,所以當凝膠中含有游離的溴化乙錠(0.5ug/ml)時,可以檢測到少至10ng的DNA條帶。


  溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸(DNA或RNA)。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小,所以其熒光產率也相對較低。事實上,大多數對單鏈DNA或RNA染色的熒光時通過染料結合到分子內形成較短的鏈內螺旋產生的。


  盡管在該染料存在的情況下,線狀DNA的電泳遷移率約降低15%,因此,當需要知道DNA片段的準確大小(如DNA限制酶酶切圖譜的鑒定),凝膠應該在無EB情況下電泳,電泳結束后用EB染色。染色完畢后,通常不需要脫色。但是在檢測小量DNA(小于10ng)片段時,通常要將染色后的凝膠進行脫色。


一、溴化乙錠的損害


  溴化乙錠可以嵌入堿基分子中,導致錯配。溴化乙錠是強誘變劑,具有高致癌性!


  SYBR Green I 和溴化乙啶(EB)Ames 測試結果顯示EB容易引起有機體突變。(Singer et al., Mutat. Res. 199, 439: 37- 47.)


溴化乙錠溶液的凈化處理


  由于溴化乙錠具有一定的毒性,實驗結束后,應對含EB的溶液進行凈化處理再行棄置,以避免污染環境和危害人體健康。


  (1) 對于EB含量大于0.5mg/ml的溶液,可如下處理:


  ①將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml;


  ②加入一倍體積的0.5mol/L KMnO4,混勻,再加入等量的2.5mol/L HCl,混勻,置室溫數小時;


  ③加入一倍體積的2.5mol/L NaOH,混勻并廢棄。


  (2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理:


  ① 按1mg/ml的量加入活性炭,不時輕搖混勻,室溫放置1小時;


  ② 用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。


CTAB緩沖液(DNA提取液)


 十六烷基三甲基溴化銨 別稱:西曲溴銨、溴棕三甲基銨、溴烷銨,鯨熔三甲基溴化銨;CTAB;CTMAB;HTAB;CTABr;陽性皂


  英文名 Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide;Cetrimonium Bromide


  分類 季銨鹽


  代碼 A-15 CAS號 57-09-0 EINECS 登錄號 200-311-3


  分子式 C16H33(CH3)3NBr


  分子量 364.446


  熔點:250-237℃ 水溶性 13 g/L (20°C) 純度(含量) >99%


二、物理化學性質


  本品呈白色或淺黃色結晶體至粉末狀,有刺激氣味,易溶于異丙醇,可溶于水,震蕩時產生大量泡沫,能與陽離子、非離子、兩性表面活性劑有良好的配伍性。具有優良的滲透、柔化、乳化、抗靜電、生物降解性及殺菌等性能。本品化學穩定性好,耐熱、耐光、耐壓、耐強酸強堿。


用途 本品為天然、合成橡膠、硅油和瀝青乳化劑;合成纖維、天然纖維和玻璃纖維的抗靜電劑、柔軟劑;護發素的調理劑;相轉移催化劑;乳液起泡劑、表面活性劑,分析試劑,滌綸真絲化劑,皮革加脂劑,它還用于助焊劑、焊錫膏生產里起表面活性劑作用,活性強,對亮點、虛焊、焊電飽滿都有一定作用。


  HLB值15.8,熔于熱水、乙醇、三氯甲烷,易熔于異丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于醚。有良好的表面活性、穩定性、殺菌性及生物降解性。在強酸及強堿中穏定,耐熱、耐光。與非離子及兩性離子表面活性劑有良好的配伍性,對多種油脂具較好的乳化作用.對皮膚及粘膜刺激性小,有輕微脫脂作用。


是一種陽離子去污劑,廣泛用于潤濕、殺菌、抗靜電、去污、增溶等方面。可用作纖維高效抗靜電劑。工業及油田水處理中用作殺菌滅藻劑、粘泥剝離劑。牙膏中用作口腔殺菌劑。用于香波及護發素,可使頭發易于梳理、光滑、柔軟。


還右用作礦物浮選劑、電鍍液緩蝕劑、瀝青乳化劑、硬表面清洗劑及有機合成相轉移催化劑等。還具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在這種條件下,蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里,在高離子強度的溶液里,CTAB與蛋白質和大多數酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物,只是不能沉淀核酸。


因此,CTAB可以用于從大量產生粘多糖的有機體如植物以及某些革蘭氏陰性菌(包括E.coli的某些株)中制備純化DNA 。


三、重要用途


提取DNA配方


  CTAB為十六烷基三甲基溴化銨,

  CTAB提取緩沖液的經典配方

  Tris-HCl (pH8.0)提供一個緩沖環境,防止核酸被破壞;

  EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;

  NaCl 提供一個高鹽環境,使DNP充分溶解,存在于液相中;

  Cβ-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA。

  CTAB 4g

  NaCl 16.364 g

  1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)

  0.5M EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌

  冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇(400ul)氯仿-異戊醇(24:1):先加96ml氯仿,再加4ml異戊醇,搖勻即可。


提取RNA配方


  2% CTAB(W/V)

  2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V)

  100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理的水配置)

  25mM EDTA

  0.5g/L 亞精胺Spermidine

  2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,使用前加入)

  由于在高溫滅菌條件下,Tris-HCl要和DEPC發生反應,所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC 處理的水配制即可。





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