凝膠層析（分子排阻層析）的種類、操作及應(yīng)用
相關(guān)專題
凝膠層析是一種利用被分離蛋白質(zhì)分子量的差異進(jìn)行分離的層析技術(shù) ，又名凝膠過濾或分子篩層析或分子排阻層析。分子排阻層析最大的優(yōu)勢(shì)在于實(shí)驗(yàn)所需條件極其溫和。
凝膠層析簡(jiǎn)介
凝膠層析(gel chromatography)又稱為凝膠排阻層析(gel exclusion chromatography)、分子 篩層析(molecular sieve chromatography)、凝膠過濾(gel filtration)、凝膠滲透層析(gel permeation chromatography)等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個(gè)組分的液相色譜方法。
1959年，Porath和Flodin首次用一種多孔聚合物-交聯(lián)葡聚糖凝膠作為柱填料，分離水溶液中不同分子量的樣品，稱為凝膠過濾。
1964年，Moore制備了具有不同孔徑的交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，能夠進(jìn)行有機(jī)溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析(流動(dòng)相為有機(jī)溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析)。隨后這一技術(shù)得到不斷的完善和發(fā)展，目前廣泛的應(yīng)用于生物化學(xué)、高分子化學(xué)等很多領(lǐng)域。
凝膠層析是生物化學(xué)中一種常用的分離手段，它具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛用于蛋白質(zhì)(包括酶)、核酸、多糖等生物分子 的分離純化，同時(shí)還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定、脫鹽、樣品濃縮等。
凝膠層析的基本原理
凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱 后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。
比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出;而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長(zhǎng)，流動(dòng)速度慢，所以最后流出;而分子大小介于二者之間的分子在流動(dòng)中部分滲透。
滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。
1、外水體積、內(nèi)水體積、基質(zhì)體積、柱床體積、洗脫體積
外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動(dòng)相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積。基質(zhì)體積是指凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。而柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。
洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們?cè)O(shè)柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質(zhì)體積為Vg，則有：
Vt=Vo+Vi+Vg
由于Vg相對(duì)很小，可以忽略不計(jì)，則有：
Vt=Vo+Vi
設(shè)洗脫體積為Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。對(duì)于完全排阻的大分子，由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中，故其洗脫體積Ve=Vo;對(duì)于完全滲透的小分子 ，由于它可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)(忽略凝膠本身體積Vg)，故其洗脫體積Ve=Vt。
分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。有時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)Ve ? Vt，這是由于這種分子與凝膠有吸附作用造成的。
柱床體積Vt可以通過加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測(cè)量水的體積來測(cè)定。外水體積Vo可以通過測(cè)定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來測(cè)定，一般常用藍(lán)色葡聚糖-2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。因?yàn)樗姆肿恿看?為200萬(wàn))，在各種型號(hào)的凝膠中都被排阻，并且它呈藍(lán)色，易于觀察和檢測(cè)。
2、分配系數(shù)
分配系數(shù)是指某個(gè)組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度比。對(duì)于凝膠層析，分配系數(shù)實(shí)質(zhì)上表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。
3、排阻極限
排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時(shí)被最先洗脫出來。
排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如Sephadex G-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。
4、分級(jí)分離范圍
分級(jí)分離范圍表示一種凝膠適用的分離范圍，對(duì)于分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。例如Sephadex G-75對(duì)球形蛋白的分級(jí)分離范圍為3,000-70,000，它表示分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的球形蛋白可以通過Sephadex G-75得到較好的分離。應(yīng)注意，對(duì)于同一型號(hào)的凝膠，球形蛋白與線形蛋白的分級(jí)分離范圍是不同的。
5、吸水率和床體積
吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。而床體積是指1g干的凝膠吸水后的最終體積。
6、凝膠顆粒大小
層析用的凝膠一般都成球形，顆粒的大小通常以目數(shù)(mesh)或者顆粒直徑(m)來表示。柱子的分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關(guān)。顆粒大，流速快，但分離效果差;顆粒小，分離效果較好，但流速慢。一般比較常用的是100-200目。
凝膠的種類和性質(zhì)
凝膠的種類很多，常用的凝膠主要有葡聚糖凝膠(dextran)、聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide)、瓊脂糖凝膠(agarose)以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯(lián)物。另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等等。下面將分別介紹。
1、葡聚糖凝膠
葡聚糖凝膠是指由天然高分子-葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。葡聚糖凝膠主要由Pharmacia Biotech生產(chǎn)。常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex和Sephacryl。
葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex系列，它是葡聚糖與3-氯-1,2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)相互交聯(lián)而成，交聯(lián)度由環(huán)氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型號(hào)是G-10 ? G-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率(單位是ml / g干膠)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干膠。
Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號(hào)的Sephadex的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。Sephadex中排阻極限最大的G-200為6?105。
Sephadex在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機(jī)溶液中都是比較穩(wěn)定的，可以多次重復(fù)使用。Sephadex穩(wěn)定工作的pH一般為為2-10。強(qiáng)酸溶液和氧化劑會(huì)使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex與強(qiáng)酸和氧化劑接觸。
Sephadex在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在100 ?C下40 min對(duì)凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒有明顯的影響。Sephadex由于含有羥基基團(tuán)，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(tuán)(尤其是堿性蛋白)發(fā)生吸附作用。
但一般在離子強(qiáng)度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。所以在用Sephadex進(jìn)行凝膠層析實(shí)驗(yàn)時(shí)常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex與蛋白發(fā)生吸附，但應(yīng)注意如果鹽濃度過高，會(huì)引起凝膠柱床體積發(fā)生較大的變化。
Sephadex有各種顆粒大小(一般有粗、中、細(xì)、超細(xì))可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差;細(xì)顆粒流速慢，但分辨率高。要根據(jù)分離要求來選擇顆粒大小。Sephadex的機(jī)械穩(wěn)定性相對(duì)較差，它不耐壓，分辨率高的細(xì)顆粒要求流速較慢，所以不能實(shí)現(xiàn)快速而高效的分離。
另外，Sephadex G-25和G-50中分別加入羥丙基基團(tuán)反應(yīng)，形成LH型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號(hào)為Sephadex LH-20和LH-60，適用于以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，分離脂溶性物質(zhì)，例如膽固醇、脂肪酸激素等。
Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺(N, N’-methylenebisacrylamide)交聯(lián)而成。是一種比較新型的葡聚糖凝膠。Sephacryl的優(yōu)點(diǎn)就是它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達(dá)到108，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sephadex的范圍。所以它不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質(zhì)粒、甚至較大的病毒顆粒。
Sephacryl與Sephadex相比另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是它的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性更高：Sephacryl在各種溶劑中很少發(fā)生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫，Sephacryl穩(wěn)定工作的pH一般為3~11。
另外Sephacryl的機(jī)械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，分辨率也較高，所以Sephacryl相比Sephadex可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)比較快速而且較高分辨率的分離。
2、聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺(acrylamide)與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。聚丙烯酰胺凝膠主要由Bio-Rad Laboratories生產(chǎn)，商品名為Bio-Gel P，主要型號(hào)有Bio-Gel P-2 ? Bio-Gel P-300等10種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限的10-3，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。各種型號(hào)的主要參數(shù)如附表所示。
聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻極限最大的Bio-Gel P-300為4?105。聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機(jī)溶液、鹽溶液中都比較穩(wěn)定。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性較好，在pH為1~10之間比較穩(wěn)定。
但在較強(qiáng)的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰胺凝膠易發(fā)生分解。聚丙烯酰胺凝膠非常親水，基本不帶電荷，所以吸附效應(yīng)較小。另外，聚丙烯酰胺凝膠不會(huì)象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長(zhǎng)微生物。聚丙烯酰胺凝膠對(duì)芳香族、酸性、堿性化合物可能略有吸附作用，使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液就可以避免。
3、瓊脂糖凝膠
瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。瓊脂糖是由D-半乳糖(D-galactose)和3,6-脫水半乳糖(anhydrogalactose)交替構(gòu)成的多糖鏈。它在100 ?C時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度降至45 ?C以下時(shí)，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。
瓊脂糖凝膠的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見的主要有Pharmacia Biotech生產(chǎn)的Sepharose(2B ? 4B)和Bio-Rad Laboratories生產(chǎn)的Bio-gel A等。關(guān)于各種瓊脂糖凝膠的基本參數(shù)如附表所示。瓊脂糖凝膠在pH為4-9之間是穩(wěn)定的，它在室溫下很穩(wěn)定，穩(wěn)定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。
瓊脂糖凝膠對(duì)樣品的吸附作用很小。另外瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和孔穴的穩(wěn)定性都很好，一般好于前兩種凝膠，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會(huì)發(fā)生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時(shí)洗脫速度可以比較快。
瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以0-30 ?C為宜。
Sepharose與2,3二溴丙醇反應(yīng)，形成Sepharose CL型凝膠(CL-2B ? CL-4B)，它們的分離特性基本沒有改變，但熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都有所提高，可以在更廣泛的pH范圍內(nèi)應(yīng)用，穩(wěn)定工作的pH范圍為3-13。Sepharose CL型凝膠還特別適合于含有有機(jī)溶劑的分離。
4、聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠
這類凝膠是由交聯(lián)的聚丙烯酰胺和嵌入凝膠內(nèi)部的瓊脂糖組成。它們主要由LKB提供，商品名為Ultragel。這種凝膠由于含有聚丙烯酰胺，所以有較高分辨率;而它又含有瓊脂糖，這使得它又有較高的機(jī)械穩(wěn)定性，可以使用較高的洗脫速度。調(diào)整聚丙烯酰胺和瓊脂糖的濃度可以使Ultragel有不同的分離范圍，
5、多孔硅膠、多孔玻璃珠
多孔硅膠和多孔玻璃珠都屬于無(wú)機(jī)凝膠。顧名思義，它們就是將硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)的球形顆粒。
這類凝膠屬于硬質(zhì)無(wú)機(jī)凝膠，它們的最大的特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度很高、化學(xué)穩(wěn)定性好，使用方便而且壽命長(zhǎng)，無(wú)機(jī)膠一般柱效較低，但用微粒的多孔硅膠制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以達(dá)到4?104塔板 / 米。多孔玻璃珠易破碎，不能填裝緊密，所以柱效相對(duì)較低。
多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬，多孔硅膠一般為102-5?106，多孔玻璃珠一般為3?103-9?106。它們的最大缺點(diǎn)是吸附效應(yīng)較強(qiáng)(尤其是多孔硅膠)，可能會(huì)吸附比較多的蛋白，但可以通過表面處理和選擇洗脫液來降低吸附。另外它們也不能用于強(qiáng)堿性溶液，一般使用時(shí)pH應(yīng)小于8.5。
另外值得一提的是各類凝膠技術(shù)近年來發(fā)展得很快，目前已研制出很多性能優(yōu)越的新型凝膠。例如Pharmacia Biotech的Superdex和Superrose，Superdex的分辨率非常高，化學(xué)物理穩(wěn)定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析;而Superose的分離范圍很廣，分辨率較高，可以一次性的分離分子量差異較大的混合物。
同時(shí)它的機(jī)械穩(wěn)定性也很好。關(guān)于各種凝膠產(chǎn)品的詳細(xì)情況可以參閱本書附錄以及各個(gè)公司的產(chǎn)品目錄。
凝膠的選擇、處理和保存
1、凝膠的選擇
通過前面的介紹可以看到凝膠的種類、型號(hào)很多。不同類型的凝膠在性質(zhì)以及分離范圍上都有較大的差別，所以在進(jìn)行凝膠層析實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)樣品的性質(zhì)以及分離的要求選擇合適的凝膠，這是影響凝膠層析效果好壞的一個(gè)關(guān)鍵因素。
一般來講，選擇凝膠首先要根據(jù)樣品的情況確定一個(gè)合適的分離范圍，根據(jù)分離范圍來選擇合適型號(hào)的凝膠。一般的凝膠層析實(shí)驗(yàn)可以分為兩類：分組分離(group separations)和分級(jí)分離(fractionations)，分組分離是指將樣品混合物按分子量大小分成兩組，一組分子量較大，另一組分子量較小。
例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等。分級(jí)分離則是指將一組分子量比較接近的組分分開。在分組分離時(shí)要選擇能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，這樣分離效果好。一般常用排阻極限較小的凝膠類型。
分級(jí)分離時(shí)則要根據(jù)樣品組分的具體情況來選擇凝膠的類型，凝膠的分離范圍一方面應(yīng)包括所要的各個(gè)組分的分子量，另一方面要合適，不能過大。如果分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離;如分離范圍選擇過大，則分辨率較低，分離效果也不好。
選擇凝膠另外一個(gè)方面就是凝膠顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對(duì)流速慢，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)造成擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重;顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當(dāng)也可以得到滿意的結(jié)果。
選擇時(shí)要依據(jù)分離的具體情況而定，例如樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的;如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。由于凝膠一般都比較穩(wěn)定，所以它在一般的實(shí)驗(yàn)條件下都可以正常的工作。
如果實(shí)驗(yàn)條件比較特殊，如在較強(qiáng)的酸堿中進(jìn)行或含有有機(jī)溶劑等等，則要仔細(xì)查看凝膠的工作參數(shù)，選擇合適的類型的凝膠。
2、凝膠的處理
凝膠使用前要首先要進(jìn)行處理。選擇好凝膠的類型后，首先要根據(jù)選擇的層析柱估算出凝膠的用量。由于市售的葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠通常是無(wú)水的干膠，所以要計(jì)算干膠用量：干膠用量(g)=柱床體積(ml)/ 凝膠的床體積(ml / g)。 由于凝膠處理過程以及實(shí)驗(yàn)過程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計(jì)算的基礎(chǔ)上再增加10%-20%。
葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠干膠的處理首先是在水中膨化，不同類型的凝膠所需的膨化時(shí)間不同。一般吸水率較小的凝膠(即型號(hào)較小、排阻極限較小的凝膠)膨化時(shí)間較短，在20 ?C條件下需3-4小時(shí);但吸水率較大的凝膠(即型號(hào)較大、排阻極限較大的凝膠)膨化時(shí)間則較長(zhǎng)，20 ?C條件下需十幾個(gè)到幾十個(gè)小時(shí)，如Sephadex G-100以上的干膠膨化時(shí)間都要在72小時(shí)以上。
如果加熱煮沸，則膨化時(shí)間會(huì)大大縮短，一般在1-5小時(shí)即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但應(yīng)注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態(tài)，所以不需膨化處理。另外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。
膨化處理后，要對(duì)凝膠進(jìn)行純化和排除氣泡。純化可以反復(fù)漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的細(xì)小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時(shí)間，再用水洗至中性。排除凝膠中的氣泡是很重要的，否則會(huì)影響分離效果，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。
3、凝膠的保存
凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦ǔ＜尤?.02%的疊氮化鈉，4 ?C下保存。如果要較長(zhǎng)時(shí)間的保存，則要將凝膠洗滌后脫水、干燥，可以將凝膠過濾抽干后浸泡在50%的乙醇中脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度反復(fù)浸泡脫水，至95%乙醇脫水后將凝膠抽干。置于60 ?C烘箱中烘干，即可裝瓶保存。注意膨化的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會(huì)破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。
凝膠層析的基本操作
凝膠層析的基本操作步驟與前面介紹的柱層析的操作過程基本相似，這里就不再重復(fù)了。下面主要介紹凝膠層析操作中應(yīng)注意的一些具體問題。
1、層析柱的選擇
層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對(duì)分辨率的要求來進(jìn)行選擇。一般來講，主要是層析柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率影響較大，長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高;但層析柱長(zhǎng)度不能過長(zhǎng)，否則會(huì)引起柱子不均一、流速過慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。
一般柱長(zhǎng)度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長(zhǎng)度比一般在1:25-1:100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對(duì)分辨率要求較低，所以一般比較短。
2、凝膠柱的鑒定
凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關(guān)于填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對(duì)填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無(wú)紋路、無(wú)氣泡。另外通常可以采用一種有色的物質(zhì)，如藍(lán)色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為以檢測(cè)凝膠柱的均勻程度。
如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用;如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時(shí)為了防止新凝膠柱對(duì)樣品的吸附，可以用一些物質(zhì)預(yù)先過柱，以消除吸附。
3、洗脫液的選擇
由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強(qiáng)度和選擇性的改變來進(jìn)行分離，在凝膠層析中流動(dòng)相只是起運(yùn)載工具的作用，一般不依賴于流動(dòng)相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴(yán)格。
由于凝膠層析的分離機(jī)理簡(jiǎn)單以及凝膠穩(wěn)定工作的pH范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。
4、加樣量
關(guān)于加樣前面已經(jīng)有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能造成較大的影響，加樣過多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果;加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。
加樣量的多少要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求而定：凝膠柱較大，當(dāng)然加樣量就可以較大;樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大;一般分級(jí)分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的1%-5%左右，而分組分離時(shí)加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10%-25%。
如果有條件可以首先以較小的加樣量先進(jìn)行一次分析，根據(jù)洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設(shè)要分離的兩個(gè)組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那么加樣量不能超過(Ve1-Ve2)。
實(shí)際由于樣品擴(kuò)散，所以加樣量應(yīng)小于這個(gè)值。從洗脫峰上看，如果所要的各個(gè)組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當(dāng)增加加樣量;如果各個(gè)組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會(huì)影響分離效果。
5、洗脫速度
洗脫速度也會(huì)影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恒定而且合適。保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。洗脫速度取決于很多因素，包括柱長(zhǎng)、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好
。但洗脫速度過慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，反而會(huì)降低分辨率，而且實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)大大延長(zhǎng);所以實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2-10 cm / hr，市售的凝膠一般會(huì)提供一個(gè)建議流速，可供參考。
總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求來選擇。
例如樣品中各個(gè)組分差異較小，則實(shí)驗(yàn)要求凝膠層析要有較高的分辨率，提高分辨率的選擇應(yīng)主要包括：選擇包括各個(gè)待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇分辨率高的凝膠類型，選擇較長(zhǎng)、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。
但正如前面講過的，各種選擇都有一個(gè)限度的問題，超過這個(gè)限度可能會(huì)產(chǎn)生相反的效果。另外需要提的一點(diǎn)是，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡可能的參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)以及進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以選擇最合適的實(shí)驗(yàn)條件。
凝膠層析的應(yīng)用
前面介紹了凝膠層析的基本理論以及基本實(shí)驗(yàn)操作，下面簡(jiǎn)單介紹一下凝膠層析在生物學(xué)方面的應(yīng)用。
1、生物大分子的純化
凝膠層析是依據(jù)分子量的不同來進(jìn)行分離的，由于它的這一分離特性，以及它具有簡(jiǎn)單、方便、不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)，使得凝膠層析成為分離純化生物大分子的一種重要手段，尤其是對(duì)于一些大小不同，但理化性質(zhì)相似的分子，用其它方法較難分開，而凝膠層析無(wú)疑是一種合適的方法。例如對(duì)于不同聚合程度的多聚體的分離等。
2、分子量測(cè)定
前面已經(jīng)介紹了，在一定的范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav以及Ve與其分子量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。
Kav=-b lg MW+c
Ve=-b’ lg MW+c’
由此通過對(duì)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行洗脫，作出Ve或Kav對(duì)分子量對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同的條件下測(cè)定未知物的Ve或Kav，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子量。凝膠層析測(cè)定分子量操作比較簡(jiǎn)單，所需樣品量也較少，是一種初步測(cè)定蛋白分子量的有效方法。
這種方法的缺點(diǎn)是測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性受很多因素影響。
由于這種方法假定標(biāo)準(zhǔn)物和樣品與凝膠都沒有吸附作用，所以如果標(biāo)準(zhǔn)物或樣品與凝膠有一定的吸附作用，那么測(cè)量的誤差就會(huì)比較大;上面公式成立的條件是蛋白基本是球形的，對(duì)于一些纖維蛋白等細(xì)長(zhǎng)的形狀的蛋白不成立，所以凝膠層析不能用于測(cè)定這類分子的分子量;
另外由于糖的水合作用較強(qiáng)，所以用凝膠層析測(cè)定糖蛋白時(shí)，測(cè)定的分子量偏大，而測(cè)定鐵蛋白時(shí)則發(fā)現(xiàn)測(cè)定值偏小;還要注意的是標(biāo)準(zhǔn)蛋白和所測(cè)定的蛋白都要在凝膠層析的線性范圍之內(nèi)。
3、脫鹽及去除小分子雜質(zhì)
利用凝膠層析進(jìn)行脫鹽及去除小分子雜質(zhì)是一種簡(jiǎn)便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會(huì)造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。一般常用的是Sephadex G-25，另外還有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻極限較小的凝膠類型。目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，但價(jià)格較貴。
4、去熱源物質(zhì)
熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì)。它們是一類分子量很大的物質(zhì)，所以可以利用凝膠層析的排阻效應(yīng)將這些大分子熱源物質(zhì)與其它相對(duì)分子量較小的物質(zhì)分開。例如對(duì)于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質(zhì)，凝膠層析是一種簡(jiǎn)單而有效的方法。
5、溶液的濃縮
利用凝膠顆粒的吸水性可以對(duì)大分子樣品溶液進(jìn)行濃縮。例如將干燥的Sephadex(粗顆粒)加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質(zhì)也會(huì)滲透進(jìn)入凝膠孔穴內(nèi)部，而大分子物質(zhì)則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和pH值
分子排阻層析主要是利用蛋白分子量的不同，在層析介質(zhì)中所受到的阻力不同，從而待分離的蛋白可以按照分量大小先后流出。分子排阻層析操作簡(jiǎn)單、所需實(shí)驗(yàn)條件溫和，不易改變待分離蛋白的生物活性，具有廣泛的應(yīng)用范圍。
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