可溶性糖的硅膠G 薄層層析
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1.了解薄層層析 測定可溶性糖的原理。
2.掌握硅膠G 薄層層析的操作方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
薄層層析(簡稱TLC )是一種微量而快速的層析方法，是在吸附劑或支持劑均勻涂布的薄層上進(jìn)行的，故稱薄層層析。為了使所要分析的樣品各組分得到分離，必須選擇合適的吸附劑。硅膠、氧化鋁和聚酰胺是廣泛采用的吸附劑，硅藻土和纖維素是分配層析中常用的支持劑，在吸附劑或支持劑中添加合適的粘合劑后再涂布，可使薄層緊貼在玻璃板上。
硅膠G 是一種添加了粘合劑的硅膠粉，約含12%~13%的石膏(CaS04)，它可以把一些物質(zhì)從溶液中吸附于自身表面。利用它對各種物質(zhì)吸附能力的不同，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)展層，使不同的物質(zhì)得以分離。例如，糖在硅膠G 薄層上的移動速度與糖的相對分子質(zhì)量 和羥基數(shù)有關(guān)，經(jīng)過適當(dāng)?shù)娜軇┱归_后，糖在薄板上的移動速度是戊糖>己糖>雙糖>三糖。對已分開的斑點(diǎn)顯色，而將與它位置相當(dāng)?shù)牧硪粋€(gè)末顯色的斑點(diǎn)從薄層上與硅膠G 一起刮下，以適當(dāng)?shù)娜軇⑻菑墓枘zG 上洗脫下來，就可用糖的定量測定方法測出各組分的含糖量。薄層層析與其他方法比有明顯的優(yōu)點(diǎn)：層析時(shí)間短、樣品用量范圍大(1μg~0.5g)、觀察結(jié)果方便、可以分離多種化合物等，其靈敏度比紙層析高10~100倍，顯色方法甚至可以用腐蝕性顯色劑。而且薄層層析法操作方便，設(shè)備簡單，所以薄層層析法目前應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛。
三、儀器和試劑
儀器
烘箱、吹風(fēng)機(jī)、薄層玻板(20cm×20cm)、分光光度計(jì)。
試劑
1. 1%糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：取木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖各l00mg，分別用75%的乙醇定容10mL，使其濃度均為10mg/mL。
2. 0.1mol/L 硼酸(H3BO3)溶液。
3. 層析溶劑：氯仿：甲醇=60:40(體積比)。
4. 苯胺—二苯胺—磷酸顯色劑：
取1g 二苯胺、1mL 苯胺和5mL85%磷酸溶于50mL 丙酮中。
5. 蒽酮試劑：
稱取0.2g 蒽酮和1g 硫脲于燒杯中，緩緩加入100mL 濃硫酸，邊加邊攪拌，溶解后呈黃色透明溶液.將其貯存于棕色瓶中，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，置冰箱中可存放2周
四、操作步驟
(一)硅膠G 薄層板的制備
取硅膠G 粉30g，加入75mL 0.1mol/L 硼酸溶液中，調(diào)勻后鋪于潔凈、平整的玻板上，將鋪層后的薄板于100℃烘箱中烘干。取出后即可使用，亦可貯于干燥器中備用。薄層表面要求平整，厚薄均勻。
(二)糖在硅膠G 薄層上的分離
選取制備好的薄板一塊，在距底邊1.5cm 的直線上選4個(gè)點(diǎn)，各點(diǎn)間距2cm。用毛細(xì)管分別點(diǎn)上不同的糖樣品于4個(gè)點(diǎn)，樣品量控制在5~10μg，斑點(diǎn)直徑不超過2mm，待薄層上樣品自然干操后，將薄板置于盛有層析溶劑的層折缸中，自下向上展層，當(dāng)展層溶劑到達(dá)離薄板頂端約1cm 處時(shí)取出薄板，前沿作一記號，于60℃下烘干2～3h(或在空氣中晾干)，除盡溶劑后均勻地噴上一層苯胺—二苯胺—磷酸顯色劑，于85℃下烘干10min，則各種糖分別顯出不同的顏色。
(三)糖的定量測定
分別取5塊干硅膠G 板，在每塊板上間隔均勻地點(diǎn)上同樣的5個(gè)樣，即每塊薄板上分別點(diǎn)上1μL、2μL、3μL、4μL、5μL 的糖標(biāo)準(zhǔn)液5點(diǎn)，操作方法同上，待溶液前沿到達(dá)薄板頂端lcm 處時(shí)取出，揮發(fā)盡溶劑后，將每塊板中間3個(gè)樣品層析部位用玻璃蓋住，左右面邊層折部位用顯色劑進(jìn)行定位。根據(jù)已顯色斑點(diǎn)的位置，用刀片刮下中間3個(gè)相應(yīng)部位的硅膠G 并放入試管中。在上述各試管中加1mL蒸餾水，于室溫下浸提1小時(shí)，取1mL 濾液加2mL 蒽酮試劑，于沸水浴中加熱10min，冷卻后用空白試樣調(diào)零，在波長620nm 處測出各糖的消光值A(chǔ)620。
(四)結(jié)果分析
記下各斑點(diǎn)的位置、顏色，計(jì)算Rf 值，繪出層析圖譜。
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