測(cè)序技術(shù)
在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測(cè)序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發(fā)明的化學(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A，T，C，G四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。目前Sanger測(cè)序法得到了廣泛的應(yīng)用。
Sanger 法測(cè)序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。
第一節(jié) 非同位素銀染測(cè)序系統(tǒng)操作技術(shù)
一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測(cè)序系統(tǒng)是一種無放射性的序列分析系統(tǒng)，它通過靈敏的銀染方法檢測(cè)凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對(duì)于放射性或熒光法來說更加快速，廉價(jià)的替代方法。測(cè)序結(jié)果可以在同一天內(nèi)得到；電泳完成后經(jīng)90分鐘就可讀序，這是常規(guī)的放射性測(cè)序法做不到的。
此外, SILVER SEQUENCETM系統(tǒng)用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物， 減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費(fèi)。該系統(tǒng)不需要放射性方法中對(duì)同位素的謹(jǐn)慎操作，也不需要熒光法或化學(xué)發(fā)光技術(shù)的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數(shù)熒光法那樣用儀器來檢測(cè)序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時(shí)極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。本系統(tǒng)利用的測(cè)序級(jí)Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產(chǎn)品，對(duì)于雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的準(zhǔn)確性，能產(chǎn)生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統(tǒng)包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區(qū)域所引起的條帶壓縮現(xiàn)象。
退火溫度是熱循環(huán)測(cè)序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。提高引物結(jié)合模板配對(duì)的嚴(yán)謹(jǐn)性。鏈重退火和模板二級(jí)結(jié)構(gòu)則限制了小片斷PCR產(chǎn)物(<500bp)得到清楚的序列數(shù)據(jù)的能力。引物延伸起始于每個(gè)循環(huán)的退火階段。在較低溫度時(shí)，聚合酶可能會(huì)遇到堅(jiān)固的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域，它可導(dǎo)致聚合酶解離。
則在四個(gè)電泳道中均有同一相對(duì)位置的條帶。因?yàn)檫@些原因，應(yīng)該使用盡可能高的退火溫度。對(duì)于有牢固二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環(huán)模式。一般來說，較長(zhǎng)的引物及GC含量高的引物能得到較強(qiáng)的信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結(jié)果。
由于本系統(tǒng)采用熱循環(huán)裝置, 與常規(guī)的測(cè)序方法相比具有如下幾點(diǎn)好處：
(1).本方法線性擴(kuò)增模板DNA產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物使銀染技術(shù)能夠檢測(cè)序列條帶，測(cè)序反應(yīng)需要0.03--2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。
(2). 在每一個(gè)變性循環(huán)中的高溫可以取代對(duì)雙鏈DNA(dsDNA)模板的堿變性及乙醇沉淀過程，變性循環(huán)也有助于消除由于線性dsDNA模板(如PCR反應(yīng)產(chǎn)物)快速重退火所引起的問題。
(3). 高溫聚合酶反應(yīng)減弱了DNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，允許聚合酶穿過高度二級(jí)結(jié)構(gòu)化的區(qū)域。
二、材料
待測(cè)已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。
三、設(shè)備
高壓電泳儀，測(cè)序用電泳槽，制膠設(shè)備，PCR儀。
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