熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）
實驗原理
熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。
雜交所用的探針大致可以分類三類：
1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號強(qiáng)，易于檢測；
2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；
3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。
探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時步驟簡單，但由于不能進(jìn)行信號放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。
實驗用具及材料
| 材料及 試劑 人的MyoD1（MYF3）基因探針 人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本 指甲油 甲酰胺 氯化鈉 檸檬酸鈉 氫氧化鈉 吐溫20 | 用具 恒溫水浴鍋 培養(yǎng)箱 染色缸 載玻片 Nikon E-400熒光顯微鏡 蓋玻片 封口膜 200μL 移液器 暗盒 |
相關(guān)溶液的配制
20×SSC：175.3g NaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調(diào)pH 至7.0）。
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