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DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割

1) 內(nèi)切酶失活

標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性

2) DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子

將DNA過(guò)柱純化，乙醇沉淀DNA

3) 條件不適（ 試劑 、溫度）

檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳

4) DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化

換用對(duì)DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)菌菌株

5) DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如Dpn I）

換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增

6) DNA位點(diǎn)上存在其它修飾

將DNA底物與λDAN混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證

7) DNA不存在該酶識(shí)別順序

換用其它的酶切割DNA或過(guò)量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證

DNA切割不完全

1) 內(nèi)切酶活性下降

用5-10倍量過(guò)量消化

2) 內(nèi)切酶稀釋不正確

用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶

3) DNA不純，反應(yīng)條件不佳

同上

4) 內(nèi)切酶識(shí)別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存其它修飾

同上

5) 部分DNA溶液粘在管壁上

反應(yīng)前離心數(shù)秒

6) 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)

將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積

7) 酶切后DNA粘末端退火

電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷

8) 由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性

使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩

9) 過(guò)度稀釋使酶活性降低

適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏

10)反應(yīng)條件不適

使用最佳反應(yīng)體系

11)識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序

加大酶量5-10倍

DNA片段數(shù)目多于理倫值

1) 內(nèi)切酶星狀活性

檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%，鹽度過(guò)低，Mn2+的存在及酶：DNA值過(guò)大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量

2) 其它內(nèi)切酶污染

用λDNA作底物檢查酶切結(jié)果

3) 底物中含其它DNA雜質(zhì)

電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段

酶切后沒有觀察到DNA片段的存在

1) DNA定量錯(cuò)誤（如RNA含量較高）

用RNA酶A（無(wú)DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量

2) 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀

在反應(yīng)前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次

內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活

1) 保存溫度不合適

內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在-20℃低溫保存

2) 以稀釋形式保存

稀釋酶液不宜長(zhǎng)期存放，應(yīng)一次使用

3) 貯藏緩沖液不適當(dāng)

使用廠家推薦的貯藏緩沖液

4) 低蛋白濃度

內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存

電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一

1) DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì)

電泳前上樣液65℃加熱5min，并加入0.1%的 SDS ，酚/氯仿抽提純化

2) 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶

減少酶用量或消化時(shí)間，換用新包裝的酶

酶切后的DNA片段連接效率低

1) 含磷酸鹽的濃度高

透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽

2) 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶

延長(zhǎng)滅活時(shí)間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA

3) 平末端連接

加大T4 DNA Ligase用量

4) 外切酶污染

減少酶用量，縮短保溫時(shí)間，酚抽提回收DNA

5) 連接 緩沖液 不合適

重新配制連接 緩沖液