酶切常見問題總結
一、DNA完全沒有被內切酶切割
二、DNA切割不完全
三、DNA片段數目多于理倫值
四、酶切后沒有觀察到DNA片段的存在
五、內切酶保存期內快速失活
六、電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一
七、酶切后的DNA片段連接效率低
問題 | 原因 | 解決辦法 |
DNA完全沒有被內切酶切割 | 1) 內切酶失活 | 標準底物檢測酶活性 |
2) DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內切酶抑制因子 | 將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA | |
3) 條件不適（ 試劑 、溫度） | 檢查反應系統是否最佳 | |
4) DNA酶切位點上的堿基被甲基化 | 換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質粒DNA轉化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株 | |
5) DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I） | 換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質粒轉至dcm+ dam+菌株中擴增 | |
6) DNA位點上存在其它修飾 | 將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證 | |
7) DNA不存在該酶識別順序 | 換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證 | |
DNA切割不完全 | 1) 內切酶活性下降 | 用5-10倍量過量消化 |
2) 內切酶稀釋不正確 | 用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶 | |
3) DNA不純，反應條件不佳 | 同上 | |
4) 內切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存其它修飾 | 同上 | |
5) 部分DNA溶液粘在管壁上 | 反應前離心數秒 | |
6) 內切酶溶液粘度大，取樣不準 | 將內切酶稀釋，增大取樣體積 | |
7) 酶切后DNA粘末端退火 | 電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 | |
8) 由于反應溶液、溫度、強烈振蕩使內切酶變性 | 使用標準反應緩沖液及溫度，避免強烈振蕩 | |
9) 過度稀釋使酶活性降低 | 適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏 | |
10)反應條件不適 | 使用最佳反應體系 | |
11)識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序 | 加大酶量5-10倍 | |
DNA片段數目多于理倫值 | 1) 內切酶星狀活性 | 檢查反應條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導致星狀活性，降低酶的用量 |
2) 其它內切酶污染 | 用λDNA作底物檢查酶切結果 | |
3) 底物中含其它DNA雜質 | 電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段 | |
酶切后沒有觀察到DNA片段的存在 | 1) DNA定量錯誤（如RNA含量較高） | 用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量 |
2) 在酶切反應液中形成非特異的沉淀 | 在反應前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次 | |
內切酶保存期內快速失活 | 1) 保存溫度不合適 | 內切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應在-20℃低溫保存 |
2) 以稀釋形式保存 | 稀釋酶液不宜長期存放，應一次使用 | |
3) 貯藏緩沖液不適當 | 使用廠家推薦的貯藏緩沖液 | |
4) 低蛋白濃度 | 內切酶與500ug/ml的BSA一起保存 | |
電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一 | 1) DNA上結合有蛋白質 | 電泳前上樣液65℃加熱5min，并加入0.1%的 SDS ，酚/氯仿抽提純化 |
2) 內切酶中含有DNA外切酶 | 減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶 | |
酶切后的DNA片段連接效率低 | 1) 含磷酸鹽的濃度高 | 透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 |
2) 內切酶失活不全或含有ATP酶 | 延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA | |
3) 平末端連接 | 加大T4 DNA Ligase用量 | |
4) 外切酶污染 | 減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA | |
5) 連接 緩沖液 不合適 | 重新配制連接 緩沖液 |
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