離子層析柱的使用心得總結
在培養(yǎng)細胞的同時，一直在進行多糖的純化工作，由于剛開始也是進行離子層析純化的摸索工作，所以一直都進行的不太順利，問題很多，其中遇到的問題解決了不少，目前為止，進展還是一切順利!現(xiàn)總結了離子層析柱 的基本操作方法和經(jīng)驗總結如下：
我使用的是DEAE-Sepharose FF(DEAE瓊脂 糖凝膠)。新膠在處理時，主要是為了除掉保護液20%的乙醇，可以用蒸餾水在抽濾時進行反復的沖洗，直至洗至中性為止，在洗的過程中膠會有很多氣泡，可以用真空或超聲波進行脫氣，靜止，就可以進行裝柱了。
(1) 凝膠柱的裝填
將層析柱 (Φ2.6×20cm)于地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將溶脹后的DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠調成較稀薄的漿液盛于柱頂?shù)娜萜髦校缓笤谳p微攪拌下使凝膠下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速。平衡凝膠床約兩倍柱體積左右，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(如藍色葡聚糖)來觀察色帶的移動，如果色帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
注意：層析柱 一定要配套的，不可混用，如果出現(xiàn)漏液及氣泡，只能重新裝柱，會很浪費時間的。我就是因為柱子不配套，柱子一個一個拆開，排查原因，換配件，耽誤了很長時間。柱子裝好后，平衡時一定要時刻觀察，防止出現(xiàn)氣泡及漏液，一旦出現(xiàn)狀況立即解決，若在進樣時出現(xiàn)問題，將會讓你很崩潰的~
(2) 上樣
取粗多糖樣品0.1g，用超純水溶解，配成濃度為10mg/ml的溶液，過0.45μm濾膜后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Φ2.6×20cm)，流速為1mL/min，用部分收集器收集洗脫液，每5ml收集一管，洗脫至洗脫液沒有多糖檢出為止。
注意：開始時，我使用此條件進行摸索的，先用蒸餾水進行洗脫，直至沒有糖檢出為止，然后設置不同的氯化鈉濃度梯度，進行洗脫。條件摸索完之后，然后可以進行多次大量的純化，收集所需要的組分峰。
a、用苯酚-硫酸法測定其中的多糖含量。以管數(shù)為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得到多糖的洗脫曲線，并分別收集不同洗脫峰各管洗脫液。
b、在280nm的紫外分光光度計 測每管的吸光度值，以管數(shù)為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得到蛋白質的洗脫曲線。
在用陰離子交換層析柱純化多糖過程中，以不同離子強度的鹽溶液洗脫，分部收集洗脫液，合并多糖單一峰部分，透析,濃縮。
(3)凝膠的再生
可以用氫氧化鈉進行再生，然后用蒸餾水洗至中性即可，經(jīng)過實驗驗證，對分離效果沒有影響。
(4) 凝膠柱的保存
一次裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。另外可以用20%的乙醇進行保存，4℃冰箱儲存即可。
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