粗蛋白的定量測定—微量凱氏定氮法
一、實驗?zāi)康?/span>
1.掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。
2.學(xué)會使用凱氏定氮儀。
二、實驗原理
蛋白質(zhì)是由碳、氫、氧、氮及少量硫元素組成。這些元素在蛋白質(zhì)中含量都有一定比例關(guān)系，其中含碳50～55%、氫6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的磷、鐵、鋅、銅和鉬等元素。
由于氮元素是蛋白質(zhì)區(qū)別于糖和脂肪的特征，而且絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的氮元素含量相當接近，一般恒定在15～17%，平均值為16%左右，因此在蛋白質(zhì)的定量分析中，每測得1克氮就相當于6.25克蛋白質(zhì)。所以只要測定出生物樣品中的含氮量，再乘以6.25，就可以計算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。
生物樣品中的含氮量可用以下反應(yīng)來測定：
含氮有機物與濃硫酸共熱，被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，氮進一步與硫酸作用生成硫酸銨。由大分子分解成小分子的過程通常稱為”消化”。為了加速消化，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高消化液的沸點(290℃→400℃)，加入硫酸銅作為催化劑，過氧化氫作為氧化劑，以促進反應(yīng)的進行。
反應(yīng)(1)(2)在凱氏燒瓶內(nèi)完成，反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進行，其特點是將蒸汽發(fā)生器、蒸餾器及冷凝器三個部分融為一體。由于蒸汽發(fā)生器體積小，節(jié)省能源，本 儀器 使用方便，效果良好。
硫酸銨與濃堿作用可游離出氨，借水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收
氨后使溶液中的H + 濃度降低，然后用標準無機酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來H + 濃度為止，最后根據(jù)
所用標準酸的量計算出待測物中總氮量。
三、 儀器 和 試劑
儀器
消化管或凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、電爐、100mL 錐形瓶、100mL 量筒、表面皿、酸式滴定管、小漏斗、玻璃珠等。
試劑
1. 血清或卵清蛋白等其他含蛋白質(zhì)樣品
2. 消化液：30%過氧化氫、硫酸與水的比例為3∶2∶1，臨用時配制。
3. 催化劑：硫酸銅(CuSO 4 ?5H 2 O)與硫酸鉀(K 2 SO 4 )以1：3配比研磨混合。
4. 50%氫氧化鈉溶液
5. 2%硼酸溶液
6. 標準鹽酸溶液(約0.01mol/L)
7. 混合指示劑(田氏指示劑)混合指示劑由50mL 0.1%甲烯藍乙醇溶液與200mL0.1%甲基紅乙醇溶液混合配成貯于棕色瓶中配用。這種指示劑酸性時為紫紅色，堿性時為綠色，變色范圍很窄且很靈敏。
四、實驗步驟
(一)安裝微量凱氏定氮儀
定氮儀由蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)室、冷凝管三部分組成。蒸汽發(fā)生器包括一個電爐及一個3～5升容積的燒瓶。反應(yīng)室上邊有兩個小燒杯，一個供加樣，一個盛放堿液。樣品和堿液由此可直接到反應(yīng)室中。反應(yīng)室中心有一長玻璃管，其上端通到反應(yīng)室外層，下端靠近反應(yīng)室的底部。反應(yīng)室下端底部有一開口，上有橡皮管和管夾。由此放出反應(yīng)廢液。反應(yīng)所產(chǎn)生的氮可通過反應(yīng)室上端細管經(jīng)冷凝管通入收集瓶中。反應(yīng)室與冷凝管之間由橡皮管相連。
安裝儀器時，將蒸汽發(fā)生器垂直地固定在鐵架臺上，用橡皮管把蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)室、冷凝管連接起來。橡皮管連接的部位應(yīng)在同一水平位置。冷凝管下端與實驗臺的距離以放得下收集瓶為準。安裝完畢后，不得輕易移動，以免儀器損壞。要認真檢查整個裝置是否漏氣，以保證所測結(jié)果的準確性。
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