病毒衣殼裝配和核酸包裝機制的研究進展
關鍵詞： 病毒衣殼裝配 核酸包裝 機制
病毒是目前所知最簡單的生命單位，只有核酸和蛋白 質組成。病毒衣殼裝配和核酸包裝機制的研究對病毒復制、病毒病防治和闡明生命活動的基本規(guī)律具有重要意義。分子病毒學的研究成果促進了病毒衣殼裝配和核酸包裝機制的研究，近幾年有關病毒裝配和核酸的包裝機制研究取得了較大的進展。本文就病毒衣殼的裝配途徑、裝配原理、核酸包裝機制和包裝信號序列等綜述如下。
1 病毒衣殼裝配途徑
病毒顆粒主要由核酸和蛋白 質組成，核心為病毒基因組，為病毒增殖和遺傳變異提供遺傳信息。衣殼可保護病毒核酸免受外界因素影響破壞，并可介導病毒核酸進入細胞內部，衣殼是病毒的主要抗原成份，是研制病毒蛋白 疫苗的主要靶位。病毒衣殼是由病毒結構蛋白 裝配形成的，病毒主要衣殼蛋白 具有自身裝配成病毒樣顆粒的特性(virus-like particle, VLP)，即無有核酸的病毒空衣殼。有些病毒可能還需病毒編碼的骨架蛋白 (scaffolding protein)輔助，這些病毒衣殼被稱為原頭(prohead)、原殼(procapsid)或病毒樣顆粒(Virus-like particle, VLP)
［1］。噬菌體衣殼裝配首先由12個孔道蛋白 gpI聚合成玫瑰形的十二聚體頂角，此頂角為病毒核酸包裝和感染細菌過程中核酸出入的通道
［2］。在皰疹病毒感染的細胞內有三種衣殼：A型衣殼為一空殼，不含病毒核酸及內部結構；B型衣殼又稱中間型衣殼，不含病毒核酸，但在病毒外殼內還有一蛋白 質層；C型顆粒為完整的病毒顆粒。B型衣殼是A、C型的前體，B型衣殼的蛋白 質層為骨架蛋白 ，由VP21、VP22a組成，在A型和C型中消失。病毒衣殼中主要衣殼蛋白 VP5約占70%，其余衣殼蛋白 VP19c、VP23、VP26約占30%，僅有這4種衣殼蛋白 還不能形成病毒衣殼，只能形成異型多聚體。只有在骨架蛋白 輔助下方可形成HSV B型衣殼。HSV病毒衣殼裝配可分為以下幾步：
(1)病毒主要衣殼蛋白 (VP5)與蛋白 酶(VP24)前-VP21及前-VP22a共價形成小分子復合物，在附件蛋白 (VP19c、VP23)輔助下逐漸形成部分衣殼和完整的B型衣殼。VP5形成HSV-1的衣殼主要部分，前-VP21和前VP22a為骨架蛋白 ，形成衣殼內部蛋白 質層。蛋白 酶VP24在兩層之間發(fā)揮橋梁作用。
(2)VP24水解前-VP21和前-VP22a，改變了骨架蛋白 的形態(tài)與結構，VP24與前-VP21分離而與VP5共價結合附著在衣殼上面，VP21與VP22a形成縮小的骨架蛋白 層。
(3)HSV DNA通過末知機制進入B型衣殼伴隨VP21、VP22a出殼，衣殼蛋白 構象變化、結構亞基重排形成為成熟C型顆粒。如果病毒DNA包裝失敗，骨架蛋白 出殼或降解，而VP24與VP5共價連接形成A型衣殼。HSV衣殼經GuHcl處理后，病毒DNA以細條帶形式從衣殼頂角處出殼［3］。因此認為HSV衣殼五鄰體頂角為病毒DNA出入衣殼的位置，GuCl處理導致五鄰體短暫開放，DNA出殼后再恢復原始狀態(tài)［4］。
2 病毒衣殼裝配的幾何原理
60年代初，Kaspar和Klug等提出用準等構理論(theory of quasiequivalence)解釋大量病毒蛋白 亞基組成球狀病毒20面體立體對稱結構的機理。根據(jù)這一理論，所有結構蛋白 亞基在組成球狀殼體的排列，并不嚴格按照球狀所要求的嚴格等構方式，而是由亞基之間連接發(fā)生一些畸變，從而導致了輕微的不對稱，這樣大量結構蛋白 亞基只有根據(jù)20面體立體對稱，形成一個等距球體。衣殼應有20個面，12個頂角，30條邊，且有5、3、2三種對稱軸，蛋白 亞基具有相同的構象，衣殼由五鄰體和六鄰體構成，只能有12個五鄰體，六鄰體的數(shù)目為10的倍數(shù)［6］。然而還有一些病毒為非準等構理論結構，如乳多空病毒衣殼由72個殼粒組成，全部為五鄰體，其中有12個五價五鄰體和60個六價五鄰體。電鏡研究表明病毒結構蛋白 可存在幾種不同的構象，如P22噬菌體衣殼蛋白 gp5有7種構象、SV40的VP1共有六種構象。因而Berger等于1993年提出局部法則理論［7］(local rule-based theory)認為病毒結構蛋白 亞基可具有幾種不同構象，蛋白 亞基構象間的特異識別及聚合形成病毒衣殼裝配的動力，進而形成一個閉合的衣殼。若在蛋白 亞基裝配過程中有一次構象識別錯誤，則導致衣殼形成不能閉合的螺旋狀結構。病毒的空心衣殼與成熟的病毒顆粒衣殼結構還有一些顯著差別。病毒空心衣殼結構疏松，沿衣殼的5、3、2對稱軸上有貫穿衣殼的裂孔。當病毒DNA包裝完成以后，病毒衣殼變得致密，裂孔關閉，至少在衣殼內2/3處關閉。伴隨病毒核酸包裝，病毒衣殼膨脹，衣殼蛋白 構象可發(fā)生變化［8］。如噬菌體HK97為20面體立體對稱結構，衣殼由415主要結構蛋白 構成，衣殼蛋白 亞基分子量為42KDa，無骨架蛋白 ，在病毒衣殼裝配過程中可出現(xiàn)4種衣殼演變形成：
①proheadⅠ：由415個42KDa的結構蛋白 亞基構成，衣殼蛋白 之間無酶解、共價交聯(lián)和構象變化，易被離解為多個殼粒。②proheadⅡ：衣殼大小不變，由于衣殼蛋白 氨基端被水解而變?yōu)?1KDa，所以衣殼內層密度變弱。
③HeadⅠ：病毒核包裝，衣殼膨脹，厚度變小，成為多角體，殼粒結構發(fā)生明顯變化，各結構蛋白 亞基之間發(fā)生交聯(lián)。④HeadⅡ：酶解后的31KDa衣殼蛋白 亞基之間以共價鍵交聯(lián)，形成5、6個或多個蛋白 亞基形成的寡聚體，衣殼蛋白 構象發(fā)生變化，各亞基之間重排形成牢固的20面體立體對稱結構。
3 病毒核酸包裝機制
病毒核酸包裝可能有兩種包裝機制，一種以乳多空病毒為代表，病毒基組與細胞組蛋白 首先形成微型染色體，然后病毒結構蛋白 以病毒微型染色體為支架，不同構象的蛋白 亞基之間特異識別與聚體逐漸裝配形成封閉的病毒顆粒，核酸包埋其中，似“作繭自縛”。但在無病毒DNA時，衣殼蛋白 仍可裝配病毒樣顆粒(VLP)，表明病毒衣殼裝配是不必依賴于其DNA為支架的［9］。另一種以噬菌體、腺病毒、皰疹病毒為代表，其機制為病毒結構蛋白 在細胞內預先形成衣殼，然后病毒DNA被特異識別并包裝進入衣殼，形成完整的病毒顆粒。這類病毒DNA復制時，病毒基因組可從多個復制起始點開始，一個復制周期完成之前，下一個復制周期已開始形成基因組首尾相接的串聯(lián)體(Concatamer)，病毒以串聯(lián)體為底物，由病毒編碼的包裝酶(package enzyme)或未端酶(Terminase)將病毒基因組從串聯(lián)體上包裝起始點特異切割(首次切割)，當一個單位的病毒基因組從孔道蛋白 或五鄰體進入并充滿衣殼后，由Head機制啟動末端切割，從而完成病毒DNA包裝。而某些病毒DNA復制結束后，就形成一個完整的基因組，如腺病毒DNA5′端共價連接DNA結合蛋白 TBP，在包裝過程中不需對DNA切割［10］。
病毒包裝酶是由病毒基因編碼，分為大小兩個亞基，大亞基可特異結合病毒衣殼頂角處的孔道蛋白 、金屬離子及ATP。小亞基可特異識別與結合病毒核酸及ATP。包裝酶都具有保守的ATP結合框架，因而具有ATP酶活性。在DNA包裝過程中，每包裝兩個堿基對則需消耗一個ATP。依據(jù)包裝酶對DNA切割的特異性不同又可分為三種類型：第一類為特異的首末次切割，因而病毒衣殼中核酸具有相同的長度，如SV40、T3、T7噬菌體。第二類為在病毒DNA特定區(qū)域發(fā)生非序列特異性切割，如T1、P2、P22、SPP噬菌體，病毒衣殼中核酸長度有輕微差異。第三類為完全非特異性切割，如T-even, 因而衣殼中的核酸是隨機的［11］。最近研究發(fā)現(xiàn)噬菌體Φ29包裝機制與其它噬菌體又有不同：在其DNA包裝過程中還需一病毒DNA5′端編碼的一小段RNA被稱為包裝RNA(pRNA)。pRNA5′和3′端在DNA包裝過程中發(fā)揮關鍵作用［12］。pRNA一端可結合于P22孔道蛋白 上，另一端則以短暫互補方式結合于病毒基因組5′端。病毒核酸進入衣殼的方式有以下幾種學說：包裝酶與孔道蛋白 形成滲透壓泵模型、可轉動螺紋模型、捕捉臂模型、搬手模型等。病毒DNA進入衣殼后其體積將是包裝前的1/30～1%。
4 病毒基因組包裝的信號序列
病毒核酸包裝是一個復雜的過程，是蛋白 質與蛋白 質及蛋白 質與核酸之間的復雜作用引起的。病毒結構蛋白 或病毒包裝酶識別病毒核酸，并從細胞大量DNA中特異選擇包裝病毒DNA，其機制目前尚不十分清楚。但大量研究表明在病毒基因組上游調節(jié)區(qū)或編碼包裝酶的基因中有一核酸包裝信號序列，稱為包裝序列(Pac序列)。某些病毒pac序列包括包裝酶特異識別與切割兩個部分。包裝序列可與包裝酶或衣殼結構蛋白 發(fā)生特異識別。目前研究較為深入的有噬菌體、腺病毒、皰疹病毒、SV40等。噬菌體pac包裝序列包括三部分，cosN、cosQ、cosB。包裝酶gpA、gpNUI可在串聯(lián)體上cosN位點處特異切割形成粘末端，cosN為包裝酶特異切割位點，cosB為包裝酶特異識別結合點位，cosQ為基因組包裝完成以后末端切割位點。只有包裝酶在N1和N2兩點切割形成12個堿基末端方可被特異包裝。其它切割形式因不穩(wěn)定而降解［13］。腺病毒包裝信號序列位于反向重復序列ITR與EIA之間的230～380核苷酸內，有一系列AT重復序列組成，至少需3個AT重復序列參與DNA包裝。SV40的包裝信號序列為位于SV40 DNA復制起始位點ori附近的六個GC盒組成的ses結構。GC盒數(shù)目、位置及與ori距離都可影響SV40包裝效率。SV40衣殼還可選擇性包裝SV40 ses結構攜帶的外源基因，并將外源基因導入SV40敏感的靶細胞核內［14］。HBV病毒復制具有逆轉錄病毒特性，HBV轉錄的前基因組Pg RNA被HBV衣殼蛋白 選擇包裝主要是由Pg RNA近5′端一段順式元件介導的，稱為E元件。E元件決定Pg RNA被特異選擇包裝。HBV衣殼蛋白 可特異包裝E元件所攜帶的一大段外源基因。由于pac元件由大量重復序列組成且包含很多順式反應元件，那么pac元件所形成的二級結構及其相應的反式作用因子對病毒核酸包裝的影響目前尚不清楚。病毒裝配機制的研究對病毒性疾病的防治具有重要意義。由于病毒衣殼可特異包裝pac元件所攜帶外源基因，人們可借助病毒的組織親嗜性，用衣殼蛋白 將目的基因特異包裝并運送到特異靶細胞，可為人類基因治療提供理想的載體。由于病毒結構蛋白 亞基上有病毒裝配的非關鍵區(qū)域，可將外源表位上插入此處，而不影響病毒顆粒裝配，人們可借助此開發(fā)攜帶多種外源基因的嵌合病毒樣顆粒疫苗。
本文受國家自然科學基金資助(編號：3970038)
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