比色分析法和分光光度法測定蛋白質含量
【目的要求】
1. 掌握比色分析法和分光光度法基本原理、標準曲線的制作及使用，標準管法結果計算
2. 熟悉蛋白質含量測定常用方法、原理及應用
3. 了解常用可見光、紫外分光光度計 的測定原理及使用
【教學內容】
1. 酚試劑法蛋白質含量測定
Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基本原理, 722型分光光度計使用，常用蛋白質含量測定方法及應用，酚試劑法測定蛋白質含量原理、操作, 標準曲線的制備及使用
2. 雙縮脲法蛋白質含量測定
自學和獨立完成實驗并與酚試劑法比較，結果計算
3. 紫外分光光度法蛋白質含量測定
紫外分光光度法測定蛋白質含量原理，方法，優缺點，注意事項；國產752型紫外分光光度計使用，UV—260分光光度計使用，注意事項，波長掃描，標準曲線制作
【實驗原理】
一、比色分析法
許多物質本身具有一定的顏色，也有許多物質本身無顏色，在加入適當的顯色劑后生成有色物質。溶液濃度越大，顏色越深。因此可以利用比較溶液顏色深淺的方法來測定有色溶液的濃度。這種方法叫比色分析法。
1. 物質的顏色和波長：
可見光：波長（λ）400—760nm
紫外光：λ小于400nm
紅外光：λ大于760nm
光的互補：將兩種適當顏色的可見光按一定強度比例混合可得到白光，這兩種光叫互補光，該現象叫光的互補。
單色光：白光通過棱鏡后可分解成各種波長不同的色光，把具有一種波長，不能再分解的光叫單色光。
2. 溶液的顏色和光吸收的關系：
溶液的顏色，是由于不同的有色物質有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現的顏色是與它主要吸收的光相互補的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現的顏色越深。
例如：一束白光通過核黃素溶液，溶液呈黃色，是因為藍色光被吸收，而其它顏色的光均為兩兩互補，透過光只多余出黃色光，所以核黃素溶液呈黃色。
光吸收曲線：測定同一物質對不同波長光線的吸收程度，以波長為橫坐標，光密度為縱坐標作圖，所得曲線為光吸收曲線。
3. 物質濃度，液層厚度與光吸收的關系（Lambert--Beer定律）：
當一束單色光通過溶液后，光被溶液吸收的程度（D）與溶液的濃度（C），液層的厚（L）以及入射光的強度（I0）有關。溶液濃度越大，液層越厚，吸光越多，這就是物質（均勻透明固體，液體，氣體）對光的吸收定律。
lg I0 / I 意義：
當I = I0 時，lg I0 / I=0，表示溶液完全不吸收光線；
當I＜I0時，lg I0 / I值較大，表示溶液對光吸收較多；
當I→0 時，lg I0 / I值無窮大，表示光線幾乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。
由此可見，lg I0 / I表示了溶液對光的吸收程度。
表示方法： 光密度OD或D（opticaldensity）
吸光度A（Absorbance）
消光度E（Extinction）
于是，(3)式可寫成：D = KCL
公式中K為消光系數，K = D/CL，表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時的吸光度。
同一溶質，K值相同。
百分消光系數：C = 1%，L = 1cm
克分子 消光系數：C = 1克分子濃度，L=1cm
D=KCL意義：物質對光吸收程度與該物質的消光系數K，溶液濃度C，液層厚度L成正比。
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