考馬斯（Comessie)亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

【原理】
考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250 的最大光吸收峰在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm。考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)定量測(cè)定的高敏性度。
在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈青色。在595nm下，光密度與蛋白質(zhì) 含量呈線(xiàn)性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。
【操作】(常量法)
(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備：
配制lmg／ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。制備系列稀釋液，其濃度分別為1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml。
按下表操作：
搖勻，室溫靜置3分鐘。在第一管為對(duì)照管，在721型分光光度計(jì)于波長(zhǎng)595nm處比色-讀取光密度。以各管光密度為縱座標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度(μg／ml)作為橫座標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
(二)未知樣品測(cè)定：
取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理鹽水至刻度，搖勻。(此法樣品稀釋200倍)。
取試管二只，按下表操作：
搖勻，靜置3分鐘，在721型分光光度計(jì)亡波長(zhǎng)595nm比色，讀取光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得稀釋樣品蛋白質(zhì)濃度。
【計(jì)算】
未知樣品蛋白質(zhì)濃度μg／ml＝稀釋樣品濃度×稀釋倍數(shù)
【優(yōu)缺點(diǎn)】
(—)操作簡(jiǎn)便、快速；檢測(cè)靈敏；重復(fù)性好。
(二)顯色迅速。約于2分鐘內(nèi)完成染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合。所現(xiàn)顏色至少在l小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。
(三)與改良Lowry氏法相比，干擾物質(zhì)較少。
(四)當(dāng)樣品中存在較大量的十二烷磺酸鈉(SDS)、TritonX-100等去垢劑時(shí)，顯色反應(yīng)會(huì)受到干擾。如樣品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色，故必須預(yù)先處理樣品。
(五)考馬斯亮蘭G250染液不宜久存，以1-2月為宜。
(六)微量法測(cè)定蛋白含量范圍為1-10μg；常量法測(cè)以檢測(cè)范圍10-100／μg為宜。
【器材】
(一)試管l0支
(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。
（三）721分光光度法，普通比色杯4只。
【 試劑 】
(一)O.9％NaCl
(二)待測(cè)血清
(三)標(biāo)準(zhǔn)血清
(四)染液：考馬斯亮蘭G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85％(W／V)磷酸。然后加 蒸餾 水定容到1000ml。[此時(shí)溶液為0.0l％考馬斯亮蘭G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。

北京天優(yōu)福康生物科技有限公司

官網(wǎng)：http://www.jyzjsd.com/

服務(wù)熱線(xiàn)：400-860-6160 

聯(lián)系電話(huà)/微信：13718308763  

QQ:2136615612      3317607072

E-mail：Tianyoubzwz@163.com