原位聚合酶鏈式反應（in situ PCR）和原位反轉錄聚合酶鏈式反應（in situ RT-PCR）操作規程

（一）、儀器設備
英國 Thermo Hybaid 原位 PCR 儀。
（二）、操作流程
1 、原位 PCR 步驟
1 ）預處理：
（ 1 ）切片常規脫蠟；
（ 2 ） 0.2mol/L HCl 處理 10min ；
（ 3 ） 5 μ g/ml 蛋白酶 K 消化組織 37 ℃ 10min ；
（ 4 ） Nase 消化組織 37 ℃ 30min ；
（ 5 ）梯度酒精脫水，室溫干燥。
2 ）原位擴增：
（ 1 ）切片滴加特異性序列引物 30 μ LPCR 擴增反應液，覆蓋硅化蓋玻片，石蠟油封邊；
（ 2 ） PCR 熱循環： 94 ℃， 1min ； 55 ℃， 1min ； 72 ℃， 1.5min ，共 25 ～ 30 個循環， 72 ℃延伸 10min ；
（ 3 ）氯仿洗去蓋玻片， 4 ％多聚甲醛后固定 10min ，梯度酒精脫水，干燥。
3) 原位雜交：
（ 1 ）加地高辛標記探針的雜交液， 98 ℃變性 10min ， -20 ℃退火 5min ， 42 ℃雜交過夜。
（ 2 ）雜交后用 2×SSC 洗滌 10min ， 3 次， 1×SSC 洗滌 10min ， 3 次；
（ 3 ）緩沖液洗滌 10min ， 3 次；
（ 4 ）加堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體復合物， 37 ℃， 2h ；
（ 5 ）緩沖液洗滌 5min ， 3 次；
（ 6 ） NBT 、 BCIP 暗處顯色，鏡下控制，終止顯色。
（ 7 ）常規脫水：透明、封固。
2 、原位 RT-PCR 步驟
1 ）預處理：
（ 1 ）蛋白酶 K(0.3mg/mL) 54 ℃消化 20min ，蒸餾水洗；
（ 2 ） 95 ℃加熱 3min ，滅活殘存的蛋白酶。
2 ）原位擴增：
（ 1 ）在有 RNA 酶抑制劑存在的條件下，用隨機六聚物進行逆轉錄反應；
（ 2 ）用熱啟動法進行 PCR 擴增。標本加熱至 75 ℃時加上反應液，覆以蓋玻片，四周用指甲油密封。然后將溫度升至 95 ℃， 2min 。再將熱循環儀設定為 95 ℃， 45s ， 55 ℃， 1min 和 75 ℃， 45s ，共 26 次循環；
（ 3 ）擴增結束后，在 80 ℃烤 15min ～ 30min 。
3 ）原位雜交：
（ 1 ）雜交前標本 95 ℃加熱 3min ；
（ 2 ）加上雜交液，濕盒內 50 ℃過夜； 雜交液組成： 25 ％硫酸葡聚糖， 2×SSC ， 50 ％甲酰胺， 0.33mg/ml 變性的鮭魚精子 DNA ， 每 0 ． 5mL 雜交液內含生物素標記探針 1ng 。
（ 3 ）擴增的β - 肌動蛋白和 IL-6 用 DAKO 檢測試劑盒 K600( 鏈霉卵白素，生物素標記的堿性磷酸酶和硝基四氮唑藍 ) 檢測。陽性反應呈紫色。

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