Sepharose CL

(一)　原理
　　葡萄球菌A蛋白(SPA)具有與多種哺乳動物 IgG分子Fc段結合的能力，并與不同IgG亞類的結合力有所差別。利用改變PH及離子強度可洗脫結合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。
　　(二)　操作步驟
　　用0.1M PH8.0 磷酸緩沖液 浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝膠，15min。按1g干膠200ml
　　上述緩沖液充分洗滌凝膠(用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌)
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　　裝柱后用0.1M PH8.0磷酸緩沖液平衡
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　　標本可用硫酸銨粗提物，先10,000g離心除去雜質，必要時用0.22μm濾膜過濾。
　　上樣前用1M PH9.0 Tris液調整標本液PH至8.1或對平衡液透析過夜
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　　加樣，一般按25～30mgIgG／g濕膠比例加樣，室溫作用15min,0.1M PH8.0磷酸緩沖
　　液充分淋洗至淋洗液OD值為〈0.02。
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　　用不同PH的枸椽酸洗脫液洗脫，流速20ml／h。如純化小鼠IgG1一般用PH6.0；純化
　　IgG2a用PH4.0；純化IgG2b用0.1M PH3.0醋酸鹽緩沖液或0.1M PH3.0 Glycine-HCl
　　緩沖液洗脫。
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　　用PH3.0或4.0洗脫液洗脫時，用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液
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　　收集洗脫液測OD值，根據實驗需要透析除鹽后進行濃度、純度和活性測定
　　(三)　試劑器材
　　1.　SPA-Sepharose CL-4B(pharmacia)
　　2.　磷酸緩沖液0.1M PH8.0＋0.02％ NaN３
　　3.　枸椽酸緩沖液　0.1M PH6.0　┐
　　　　　　　　　　　0.1M PH4.0　├＋0.02％ NaN3
　　　　　　　　　　　0.1M PH3.0　┘
　　4.　1M PH9.0 Tris溶液
　　5.　再生緩沖液(1) 0.1M Tris含0.5M NaCl調正PH至8.5＋0.02％NaN3；(2) 0.1M
醋酸鈉含0.5M NaCl調正PH至4.5＋0.02％NaN3。
　　6.　1～10ml柱體積的玻璃柱或塑料柱
　　(四)　注意事項
　　1.　SPA-Sepharose CL-4B凝膠價格昂貴，可再生后反復使用10～20次左右。方法:先用10倍柱體積0.1M PH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；再用10倍柱體積0.1M PH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5M NaCl液洗脫柱上殘存的雜蛋白；0.1M PH8.0磷酸緩沖液平衡，4℃貯存。
　　2.　SPA-Sepharose CL-4B親和層析法還可用于:(1)除去抗體液中IgG，檢測非IgG抗體(如IgM)的生物學活性；(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； (3)回收或純化免疫 復合物。

　　3.　狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結合的能力。

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