凝膠層析法測定蛋白質分子量
一、實驗目的
1.了解凝膠層析的基本原理。
2.掌握利用凝膠層析法測定蛋白質分子量的實驗技能。
二、實驗原理
凝膠層析(gel chromatography)是20世紀60年代發展起來的一種分離分析方法。其法有許多同義詞如凝膠過濾、分子排阻層析、分子篩層析、凝膠滲透層析等。
凝膠層析是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術。凝膠的孔隙猶如”篩眼”，當被分離的物質流過凝膠柱時，分子大于凝膠”篩眼”范圍的物質完全被排阻，不能進入凝膠顆粒內部，只能隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此受到的阻滯作用小，流程短，流速塊兒先流出層析柱；分子小于”篩眼”的物質則可完全深入凝膠顆粒的”篩眼”中。因此受到的阻滯作用大，而且從一個顆粒的”篩眼”又進入另一個顆粒的”篩眼”，其流程長，流速也就慢，從層析柱中流出就較晚。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲入凝膠的物質，則居二者之間從柱中流出。從流出先后次序的不同即可達到分離和純化被分離物質的目的。
凝膠的這種特性又稱為分子篩效應，洗脫時峰的位置和該物質相對分子質量有直接的定量關系。
在一根凝膠柱中，顆粒間自由空間所含溶液的體積稱為外水體積V 0 ，不能進入凝膠孔徑的那些大分子，當洗脫體積為V0時，出現洗脫峰。
凝膠顆粒內部孔穴的總體積成為內水體積V i ，能全部透入凝膠的那些小分子，當洗脫體積為V 0 +V i 時，出現洗脫峰。
將分子篩分配系數定義為：
K= V e / V i
若生物大分子的分子為球形，其K 與生物大分子的相對分子質量間存在如下關系：
K = －lgM r + c
其中b 和c 為常數。試驗已證實這一關系的存在(排阻體積與相對分子質量的關系)。目前常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠，其中最常用的是葡聚糖凝膠。葡聚糖凝膠有不同的型號，用于分離不同相對分子質量大小的物質。本實驗用葡聚糖SephadexG—75分離胰島素(M r 為6000)和牛血清白蛋白(M r 為75000)。
三、 儀器 和試劑
儀器
層析柱1cm×90cm、恒流泵、紫外檢測儀、部分收集器、記錄儀、試管、玻璃棒。
試劑
1. 待分離樣品：胰島素、牛血清白蛋白。
2. 藍色葡聚糖-2000
3. 葡聚糖Sephadex G—75
4. 洗脫劑
四、 實驗步驟
1.凝膠的處理
葡聚糖SephadexG-75干粉經蒸餾水室溫充分溶脹24h，或沸 水浴 中3h，這樣可大大縮短溶脹時間，而且還可殺死細菌和排除凝膠內部的旗袍。溶脹過程中注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。凝膠顆粒要求大小均勻，可是流速穩定。凝膠充分溶脹后用傾泌法可將不易沉下的較細顆粒除去。將溶脹后的凝膠抽干，用10倍體積的洗脫液處理約1h，攪拌后繼續用該法除去懸浮的較細顆粒。
2.裝柱
將層析柱垂直裝好，關閉出口，加入洗脫液約1cm 高。將處理好的凝膠用等體積的洗脫劑攪成漿狀，自柱頂部沿管內壁緩緩加入柱中，待底部凝膠沉積約1cm 高時，再打開出口，繼續加入凝膠漿，只凝膠沉積至一定高度(約70cm)即可。裝柱要求連續，均勻，無氣泡，無”紋路”。
3.平衡
將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱入口相連，用2～3倍床體積的洗脫劑平衡，流速為0.5mL/min。平衡好后在凝膠表面放一片濾紙，以防加樣時凝膠被沖起。
柱裝好和平衡后可用藍色葡聚糖-2000檢查層析行為，在層析柱內加1mL(2mg/mL)藍色葡聚糖-2000，然后洗脫，流速為0.5mL/min，若色帶狹窄并均勻下降，說明裝柱良好，然后再用2倍床體積的洗脫劑平衡。
4.加樣與洗脫
將柱中多余的液體放出，使液面剛好過凝膠，關閉出口，將1mL 樣品沿層析柱管壁小心加入，加完后打開底端出口，使液面降至與凝膠面相平時關閉出口，用少量洗脫劑洗柱內壁2次，加洗脫劑至液層4cm 左右，按上恒流泵，調好流速，開始洗脫。
上樣的體積，分析用量一般為床體積的1～2%，制備用量一般為20～30%。
5收集與測定
用部分收集器收集洗脫劑，每管4mL，紫外檢測儀280nm 處檢測，用記錄儀或將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪制洗脫曲線。
6.凝膠柱的處理
一般凝膠用過后，反復用 蒸餾 水通過柱(2～3倍床體積)即可，若凝膠有顏色或比較臟，需用0.5mol/LNaCl 洗滌，再用 蒸餾 水洗。冬季一般放2個月無長霉情況，但在夏季如不用，要加入0.02%的疊氮鈉防腐。
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