動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法

前言

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開始于本世紀(jì)初，1962 年其規(guī)模開始擴(kuò)大，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場(chǎng)份額的50% 。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)制藥中非常重要的環(huán)節(jié)。目前，動(dòng)物細(xì)胞有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)，技術(shù)水平的提高主要集中在培養(yǎng)規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大、優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率與保證其質(zhì)量上。

動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)及生長(zhǎng)特性

動(dòng)物細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng), 但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比，有顯著差別：

①動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；

②倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)須用抗生素；

③培養(yǎng)過程需氧量少（氧傳質(zhì)系數(shù)kLa 大于10 h - 1即可滿足每毫升107 個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)）；

④培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在；

⑤原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高。

一、固定化動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

1.　固定化培養(yǎng)方法

在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)細(xì)胞的目的不僅僅要求催化活力，更重要的是利用細(xì)胞來合成和分泌蛋白，因此如何保持細(xì)胞的活性顯得尤為重要。由于動(dòng)物細(xì)胞的極度敏感性，上述這些固定化方法會(huì)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，另外多糖（如卡拉膠等） 由于具有很高的離子強(qiáng)度也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害。故在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附、包埋、中空纖維或膠囊化。

1. 1 　吸附

1. 1. 1 　多孔陶瓷

美國(guó)某公司開發(fā)了一種完全自動(dòng)化的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的核心是陶質(zhì)矩形蜂窩狀生物反應(yīng)器。反應(yīng)器構(gòu)型是一圓筒內(nèi)裝置有許多陶質(zhì)矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供4. 25 m2 的生長(zhǎng)表面積。既可用于培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可用于培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。該系統(tǒng)可以連續(xù)化生產(chǎn)蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，給分離純化帶來方便。而且細(xì)胞不用從培養(yǎng)基中分離，所以不必考慮梯度問題；當(dāng)培養(yǎng)基高速循環(huán)時(shí)，可以保持相對(duì)恒定的營(yíng)養(yǎng)物和氧濃度。增加套數(shù)即可實(shí)現(xiàn)放大。

1. 1. 2 　微載體

微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對(duì)細(xì)胞無毒害作用的材料支撐的顆粒（微載體），使細(xì)胞在微載體表面附著和生長(zhǎng)，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細(xì)胞提供了極大的附著表面，1 g 微載體其比表面積可達(dá)6 000 cm2 ，從而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。

微載體的直徑在60～250μm ，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細(xì)胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長(zhǎng)基質(zhì)物質(zhì)，因而有利于細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖。采用微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①比表面積大，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；

②采用均勻懸浮養(yǎng)，無營(yíng)養(yǎng)物或產(chǎn)物梯度；

③可用簡(jiǎn)單顯微鏡觀察微載體表面的生長(zhǎng)情況；

④細(xì)胞收獲過程相對(duì)簡(jiǎn)單，勞動(dòng)強(qiáng)度小；

⑤培養(yǎng)基利用率高，占地面積小；

⑥放大容易，國(guó)外已有公司以1 000 L 規(guī)模培養(yǎng)人的二倍體細(xì)胞來生產(chǎn)β- 干擾素。但其缺點(diǎn)是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細(xì)胞；接種密度高，微載體吸附力弱，不適合培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞。

1. 1. 3 　大孔微載體

人們?yōu)榱私鉀Q微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞易受機(jī)械損傷的缺陷以及能最大限度地?cái)U(kuò)大比表面積, 開發(fā)了具有完全連通溝回的大孔微載體。大孔微載體將細(xì)胞固定在孔內(nèi)生長(zhǎng)，因而與其他方法相比具有一系列優(yōu)點(diǎn)：

①比表面積大,是實(shí)心微載體的幾倍甚至幾十倍；

②細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)，受到保護(hù)，剪切損傷小；

③與包埋法相比，傳質(zhì)尤其是傳氧效果好；

④兩種類型細(xì)胞都適用；

⑤細(xì)胞三維生長(zhǎng)，細(xì)胞密度是實(shí)心微載體的10 倍以上，有的可達(dá)108 個(gè)/ mL；

⑥適用于長(zhǎng)期維持培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)情況依然良好；

⑦微載體濃度高，實(shí)心載體在培養(yǎng)液中濃度增大到一定時(shí)，細(xì)胞密度反而下降；而大孔微載體在濃度較高時(shí)，表面碰撞增加，能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)；

⑧最適合于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言，大孔微載體技術(shù)將成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。

1. 2 　包埋

將動(dòng)物細(xì)胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動(dòng)物細(xì)胞的方法稱為包埋法。此法步驟簡(jiǎn)便，條件溫和，負(fù)荷量大，細(xì)胞泄露少。因細(xì)胞嵌入在高聚物網(wǎng)格中而受到保護(hù)，細(xì)胞能抗機(jī)械剪切。但該法也有一定缺點(diǎn)，如擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳營(yíng)養(yǎng)物濃度。包埋法一般適用于非錨地依賴型細(xì)胞的固定化。多孔凝膠是最常用的載體，用于動(dòng)物細(xì)胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。

1. 2. 1 　海藻酸鈣凝膠

海藻酸鈣凝膠包埋法是將動(dòng)物細(xì)胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1 mm 內(nèi)含動(dòng)物細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠，分離洗滌后即可用于培養(yǎng)。此法操作時(shí)條件溫和，對(duì)活細(xì)胞損傷小。但固定后機(jī)械強(qiáng)度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細(xì)胞，國(guó)外已有專門的振動(dòng)噴嘴設(shè)備可供使用。

1. 2. 2 　瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細(xì)胞的瓊脂糖溶液分散到一個(gè)水不溶相中(如石蠟油) ，形成直徑0. 2 mm 凝膠珠珠, 移去石蠟油后, 細(xì)胞即可進(jìn)行培養(yǎng)。同海藻鈣一樣，瓊脂糖更適于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞。盡管凝膠珠形成過程很復(fù)雜，目前放大體積不超過20 L 。但瓊脂糖凝膠無毒性，具有較大的空隙，可以允許大分子物質(zhì)自由擴(kuò)散，因此該法特別適用于蛋白產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體和白細(xì)胞介素 。

1. 2. 3 　血纖維蛋白

將動(dòng)物細(xì)胞與血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白，將動(dòng)物細(xì)胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，因此兩種類型的細(xì)胞都適于培養(yǎng)。而且基質(zhì)高度多孔，允許大分子物質(zhì)的自由擴(kuò)散。但機(jī)械強(qiáng)度差，對(duì)剪切力很敏感。

1. 3 　中空纖維

中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細(xì)管”即中空纖維給培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。典型的封閉中空纖維如下圖：

中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是無剪切、高傳質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分的選擇性滲入，使培養(yǎng)細(xì)胞和產(chǎn)物密度都可達(dá)到比較高的水平。缺點(diǎn)是膜的污染和堵塞，觀察困難，細(xì)胞生長(zhǎng)或過量氣體產(chǎn)生會(huì)破壞纖維。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是讓細(xì)胞在管束外空間生長(zhǎng)，以達(dá)到更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度。目前中空纖維反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞來生產(chǎn)單克隆抗體。

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