細胞實驗技術及基本知識（一）

細胞周期的測定

一、原理

細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。

測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規細胞培養

2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

4、常規染色體制片（見第三部分：染色體技術）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。

9、計算：細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
　?。?）2×SSC配制： NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉-2H2O0.88克，加水至100ml，4℃保存。

細胞的凍存和復蘇

一、原理

在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。

目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

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