細胞爬片中重要的細節問題

第一，蓋玻片需要過酸，并且自來水、蒸餾水沖洗干凈。兩張或者以上的玻片很容易因為虹吸作用粘到一起，很容易沖不干凈，很容易把兩張完全重疊在一起的玻片當成一張，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒飯盒中進行，飯盒底面放上紗布，將玻片斜靠在飯盒側壁，玻片正面不要接觸紗布，否則會粘上毛毛的。然后高壓蒸汽滅菌，烤箱中烤干。

第二，爬片前最好用多聚賴氨酸或者層粘蛋白或者膠原溶液處理玻片，未處理過的細胞不容易貼壁，細胞系還好，原代細胞很少能貼得牢。這一步至關重要，否則在后面用PBS洗片時很容易將細胞洗掉。用這些促進細胞貼壁的溶液處理玻片后，放到培養皿之前需要用培養基沖洗一到三遍！層粘蛋白和膠原還好，多聚賴氨酸有幾次我沒沖結果細胞全部不貼壁。

第三，傳代消化下來的細胞一定不要過多稀釋，將濃一點的細胞懸液吹打混勻后滴在玻片上，幾個小時后再追加培養基。

第四，玻片在培養皿中容易漂起，如果事先在皿中鋪上液體很可能會不容易揭下來，或者揭下來時出印子在鏡下很難看。漂起的玻片很容易兩面都培養出細胞的，這時背面的細胞必須去除，挺難操作的，用PBS沖洗可能會傷到正面的細胞，用小鑷子夾玻片很容易夾碎，也很容易脫落，小心點好。

第五，將玻片拿出后一定要記好哪邊是正面，最好做玻片時將玻片切成長方形的。目前市場售的多為18mm x 18mm的蓋玻片，或者24mmx24mm的蓋玻片，正方形，很難分辨反正面，在某個角上打個缺口，對正方形是不中用的?？梢杂眯∩拜喦幸幌赂某砷L方形，至于在某個角上用砂輪做個標記，理論上很簡單，實際操作有難度。

第六，上面步驟都沒問題后，玻片就需要進一步處理了，這里有幾個細節，分述如下：

1.PBS對玻片是沖洗還是浸泡，我個人認為浸泡好，我吃過沖洗的虧，每一步后都要沖洗2-3次，有時還沒等試驗做完，大部分細胞已經被沖掉了，呵呵！我當時欲哭無淚??！

2.4%的多聚甲醛或者別的固定液的溫度是多少，有人認為4°C的好，有人認為37°C的好，我個人感覺，嬌貴的原代細胞先在常溫下固定較好，然后放到4°C冰箱中。我發現直接用4°C的溶液會造成細胞冷休克，從片上脫落。

3.用中性樹膠粘蓋玻片與載玻片時，盡量少滴樹膠，一點點就夠了，而且至少半個小時以上才能粘牢，防止在水中脫落。否則蓋玻片就會移動，背面會出現樹膠的印子，鏡下很難看，而且擦不掉的。

4.固定好的片子放到冰箱中保存，我倒沒怎么試過，我基本上做好的就直接做免疫組化。

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