胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(SOP)

一、細(xì)胞

多能性胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生于小鼠胚泡

1．表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）的B5-ES細(xì)胞。由Dr. Nagy的實(shí)驗(yàn)室制備。

2．D3-ATCC; CRL-1934. 我們得到時大約傳了17代。

3．J1-由Dr. Jaenish的實(shí)驗(yàn)室友情提供。我們得到時大約傳了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表達(dá)J1細(xì)胞，由Dr. Jaenish的實(shí)驗(yàn)室友情提供。

5．表達(dá)黃色熒光蛋白的YC5-ES細(xì)胞，由Dr. Nagy的實(shí)驗(yàn)室提供。

二、一般培養(yǎng)——維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)

ES細(xì)胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達(dá)到 80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細(xì)胞一次，細(xì)胞傳代以后，在將細(xì)胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細(xì)胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細(xì)胞粘附，從而將分化和未分化細(xì)胞分開。將細(xì)胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

貯存液

DMEM(高糖)
馬血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO

復(fù)蘇細(xì)胞

細(xì)胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細(xì)胞。然而，二甲基亞砜對細(xì)胞有毒性，快速的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。

步驟

1．從液氮中取出一管細(xì)胞；

2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；

3．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；

4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；

5．離心3分鐘；

6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至少吹打10次；

7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；

8．孵育。

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