抗體親和純化洗脫液的應(yīng)用

一、概述

抗體是機(jī)體對體內(nèi)存在的外來分子、微生物的抗原物質(zhì)刺激，由Ｂ淋巴細(xì)胞分化的漿細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，可以是以與膜結(jié)合的形式作為抗原受體結(jié)合于B細(xì)胞表面；也可以是以分泌的形式存在于血液或體液中，作為特異性體液免疫的效應(yīng)分子，參與清除抗原過程中的分子間相互作用。

抗體作為一種特殊的蛋白質(zhì)分子，近年來作為藥物、體外診斷試劑、免疫親和層析配基、藥物載體工具等得到了長足的發(fā)展，同時抗體也在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、生物工程等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

二、緩沖液的配制

平衡緩沖液:pH 7.4, 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (PBS, 分別含0.15、0.25、0.3、0.75 mol/LNaCl) 。洗脫緩沖液:pH 2.8, 0.1 mol/L甘氨酸緩沖液。中和緩沖液:pH 9.0, 1 mol/L Tris-HCl緩沖液。

一些純化載量較少的抗體可適當(dāng)提高需平衡緩沖液中的鹽濃度 (可達(dá)3 mol/L) 和pH值 (可達(dá)pH 8.2) , 以提高抗體和介質(zhì)的吸附力。但是, 有時高pH會增加雜蛋白吸附, 使用時應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)節(jié)。

以上緩沖液使用前均需經(jīng)0.45μm濾膜過濾。

三、應(yīng)用

(a) 裝柱:偶聯(lián)了重組蛋白A的Sepharose4FF填料裝柱后, 用洗脫緩沖液洗3~5個柱床體積洗掉乙醇和雜質(zhì), 用平衡緩沖液流洗5~10個柱床體積平衡柱。

(b) 上樣:將含免疫抗體IgG的兔血清樣品上柱, 均勻上樣, 可將流出液反復(fù)上樣, 以更好地結(jié)合IgG (樣品先用平衡緩沖液稀釋5~10倍, 以保證樣品液的pH和平衡緩沖液接近) 。

(c) 洗滌:用平衡緩沖液再洗5~10個柱床體積, 直至基線趨于平緩。

(d) 洗脫:分別以相對快速和慢速加入洗脫緩沖液, pH降至約3.0, IgG從填料上洗脫下來, 立即用上述中和緩沖液中和洗脫液至pH為中性, 防止洗脫緩沖液的酸性環(huán)境引起抗體失活。

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