重組質(zhì)粒構(gòu)建

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重組質(zhì)粒構(gòu)建是常用的分子生物學(xué)手段，其實(shí)只是最基本的方法

所涉及內(nèi)容如下：

1) 克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題

2) 載體酶切的問(wèn)題

3) 連接片段濃度比的問(wèn)題

在闡明上述問(wèn)題同時(shí)，本人盡可能舉些實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題案例予以說(shuō)明。

一、克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題

1、克隆位點(diǎn)選擇的問(wèn)題。首先要對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)掃描分析，列出其所含酶切位點(diǎn)清單。然后對(duì)照質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，所選擇的克隆位點(diǎn)必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點(diǎn)。這是常識(shí)，不贅述。

2、保護(hù)堿基數(shù)目的問(wèn)題。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入酶切位點(diǎn)后，常常要加入保護(hù)堿基，這是大家所熟知的。但是保護(hù)堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會(huì)大大影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。

一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以正常進(jìn)行；而有一類(lèi)，僅僅只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進(jìn)行，這是因?yàn)閮?nèi)切酶不能正常結(jié)合DNA片段上。如NdeI就屬這類(lèi)，需要加入至少6個(gè)保護(hù)堿基，常用的HindIII也要三個(gè)。

下面是提供這類(lèi)酶的列表及其所需最少的保護(hù)堿基數(shù)，相信下列將有助于大這家的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

案例分析一：曾選用NdeI克隆位點(diǎn)，未注意到保護(hù)堿基數(shù)目的問(wèn)題，設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入NdeI酶切位點(diǎn)后，只加上兩個(gè)保護(hù)堿基，一個(gè)月內(nèi)沒(méi)有進(jìn)展，始終不能成功構(gòu)建重組載體。后查文獻(xiàn)得知癥結(jié)所在，在NdeI序列后加上六個(gè)保護(hù)堿基后，迎刃而解。大家引以為戒。

現(xiàn)在普通酶我都引入三個(gè)保護(hù)堿基。現(xiàn)在堿基合成價(jià)格也不貴了，為保證酶切充分，連接順利，不用節(jié)約那點(diǎn)錢(qián)，再說(shuō)若一次不成功，重復(fù)實(shí)驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間與金錢(qián)更多

二、載體酶切的問(wèn)題

1、質(zhì)粒的單酶切鑒定。這個(gè)問(wèn)題似乎很簡(jiǎn)單，但我認(rèn)為很有著重強(qiáng)調(diào)之必要。現(xiàn)在大家手頭的質(zhì)粒都是轉(zhuǎn)來(lái)轉(zhuǎn)去的，其中的各酶切位點(diǎn)狀況如何，是否能被有效地切開(kāi)，這些問(wèn)題都是要核實(shí)的。因此，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前必須對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行單酶切鑒定。

現(xiàn)在我每次構(gòu)建之前，對(duì)所選擇的克隆位點(diǎn)都要作一一鑒定，例如選擇NdeI和HindIII作為克隆位點(diǎn)，就先分別對(duì)質(zhì)粒上這兩個(gè)酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行單酶切鑒定。單酶切鑒定能有效地切開(kāi)后，再發(fā)出引物合成定單，進(jìn)行引物合成；若不能，就按“一”中原則進(jìn)行調(diào)換。

2、連接反應(yīng)的對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)中，這步驟屬于質(zhì)粒載體與外源DNA片段的連接反應(yīng)。成功與否，很大程度上取決于與質(zhì)粒和DNA片段的酶切效果。

一般情況下，都在通用緩沖液中進(jìn)行雙酶切，但這兩種酶在通用緩沖液中酶切效率不一樣，這可能導(dǎo)致部分的單缺口的質(zhì)粒片段存在，這樣，在連接反應(yīng)中，即使在外源DNA片段存在下，這種單缺口的質(zhì)粒片段能夠進(jìn)行更快速有效自我連接。

最終結(jié)果是大量假陽(yáng)性的菌斑生長(zhǎng)。對(duì)照連接反應(yīng)中，在不加入外源片段情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如果有菌斑生長(zhǎng)，說(shuō)明雙酶切不充分，質(zhì)粒DNA必須重新進(jìn)行雙酶切。

實(shí)驗(yàn)案例分析2：曾用XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，直接就做連接，未上述兩步鑒定，每次結(jié)果滿板的菌斑。但就是沒(méi)有陽(yáng)性。后來(lái)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行單酶要鑒定后，發(fā)現(xiàn)XhoI酶切位點(diǎn)損壞。又是一個(gè)月沒(méi)有進(jìn)展，浪費(fèi)精力和藥品。

血的教訓(xùn)啊。因?yàn)楫?dāng)時(shí)沒(méi)有注意到：?jiǎn)吻匈|(zhì)粒是一條帶，雙切質(zhì)粒也是一條帶，電泳行為上是一樣的，分辨不出。如果做上述任何一個(gè)鑒定就會(huì)知道問(wèn)題出在那兒，呵呵。

實(shí)驗(yàn)案例分析3：本實(shí)驗(yàn)室一個(gè)號(hào)稱(chēng)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拇蟛┦浚肒pnI和HindIII構(gòu)建重組質(zhì)粒，一個(gè)月未果，只得陰性斑，不得陽(yáng)性斑，后懷疑KpnI酶失效。遷怒KpnI，在我不知情下扔掉實(shí)驗(yàn)室所有KpnI酶。我得知后，問(wèn)他做過(guò)上述兩鑒定實(shí)驗(yàn)后，他支吾著說(shuō)沒(méi)有，后經(jīng)鑒定HindIII位點(diǎn)失效。

三、連接時(shí)兩片段濃度比問(wèn)題

一般實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)上都說(shuō)質(zhì)粒：片段＝1：3（摩爾比），在實(shí)際操作中我以為在1：5甚至1：10為宜。做好“一、二”，16℃ 10小時(shí)后，每次都能有效地連接上。當(dāng)然還有大腸桿菌感受覺(jué)態(tài)問(wèn)題，我們以前自己做，現(xiàn)在懶得做了，都用“天為時(shí)代公司”的產(chǎn)品，感覺(jué)還不錯(cuò)（特別聲明我不是天為公司內(nèi)線，呵呵）。

這里介紹一個(gè)估測(cè)處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測(cè)，也可以電泳對(duì)比marker估測(cè)，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法：

1．取一平皿。

2．薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固 (4 ℃可以存一個(gè)星期)。

3．平皿背面可以畫(huà)成小方格。

4．一小格中點(diǎn)1 ul樣品。

5．另一小格格點(diǎn)1 ul DNA標(biāo)準(zhǔn)品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相當(dāng)60 ng)

6．涼干后，紫外燈下根據(jù)亮度就可以估測(cè)了。

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