蛋白質的疏水層析純化步驟
疏 水 層 析
1、 疏水層析是根據不同蛋白質的疏水力強弱不同來分離的。
在高鹽離子強度的情況下，蛋白質的疏水基團充分暴露與填料的疏水介質相互作用，從而結合在柱子上。
不同蛋白質的疏水性強弱不同從而導致其與柱子填料的結合力也不同。隨后，逐漸降低洗脫緩沖液的鹽離子強度就可以將不同的蛋白分布洗脫下來，形成一個個的蛋白質洗脫峰。
2、 柱子的裝填：如果是預裝柱，就不存在裝柱的問題了。
不是，則從頭開始：首先，把柱子洗干凈，一定要洗干凈，不然會出現氣泡。
填料預先融漲（注意，進口一般已經是融漲好的，不必再做這一步），取一定的填料（例如：想裝5.0ml的柱子，一般將瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的話）取10.0ml出來）先脫一下氣（控制不好會暴沸出來），然后緩緩裝入柱子（柱子上下口一定不要搞錯），打開下口讓水流出，最好一次性裝完，等待其自然沉降，柱子就裝好了。
（實際上，因為疏水層析的原理與分子篩不同，所以其裝柱遠遠沒有分子篩的柱子那么嚴格，很容易
3、 注意：柱子裝好之后，任何時間都不能讓緩沖液流到柱面以下而干柱！
4、 緩沖液的選擇：
a、pH值：要在蛋白質的pI值附近，因為這時蛋白質的疏水力會最強，但是也不要把緩沖液的pH正好調到pI，因為蛋白那時會發生等電點沉淀！。所以，如果你的蛋白等電點是8.5的話，配一個8.0或9.0的緩沖液應該都可以！
b、緩沖介質：常用的是PBS或者Tris-HCl緩沖液，都可以，看個人習慣了，或者，你以后的實驗要用Tris-HCl，那么這里也用Tris-HCl就是了。蛋白質技術手冊上用的是PBS，自行選擇。
c、緩沖液的濃度：依照蛋白質技術手冊上的濃度即可：20mM。
5、 樣品的處理：疏水層析是在高鹽離子強度的情況下上樣的。而且，樣品在上樣之前一定要注意沒有沉淀，有的話應該離心除去。樣品的鹽離子強度的調整：可以直接將固體的磨的很細的鹽顆粒加在樣品里，使之達到預定的濃度（是硫酸銨的話，就查手冊后面的表格，計算應該加多少鹽），或者將樣品與100%的硫酸銨等體積混合，不就變成50%的了（這樣的好處是緩沖液的濃度不會因為加入硫酸銨體積變大而降低，從而影響了樣品的pH值）
還有更加重要的是：請仔細選擇上樣的離子強度，要知道，蛋白質在高鹽的情況下是要發生沉淀的（硫酸銨沉淀純化蛋白的原理）！如果你的蛋白的硫酸銨沉淀范圍是50-80%，那么你大可放心地用50%硫酸銨來上樣！如果你的蛋白的硫酸銨沉淀范圍是30-50%，那么你就只能用30%來上樣了，千萬記住！！！還有就是，調整鹽離子強度的時候要在低溫下操作，如果有沉淀產生，輕輕地混勻一會兒，該溶解的就會溶解，離一下心，就可以上樣了。
6、 不知道你的蛋白的穩定性如何？必要的時候，請加入蛋白酶抑制劑。
7、 柱子的預平衡：10倍床體積的層析緩沖液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸銨（這個濃度要你選擇，50%還是30%？）），使其平衡。
8、 上樣：當平衡層析緩沖液流至恰好與床面相切時，關閉出液口（有泵的話，把它一關就OK!），然后上樣。注意：盡量小心，保持床面的平整性！打開出口，讓樣品緩緩進入柱床，再次相切時，加入少量（很少就可以，稍稍蓋過床面就行！）層析緩沖液（20mM PBS, 50%硫酸銨）洗一下。
9、 洗柱：注意，這一步不是洗脫，而是把一些吸附不在柱子上的雜蛋白盡量洗下來！步驟：3倍床體積的層析緩沖液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸銨）洗柱或者觀察檢測儀的信號回到基線，那就證明吸不住的雜蛋白完全洗下來了。
10、 目的蛋白的洗脫：有梯度混合儀的話，可以梯度洗脫（比如50%-0%洗脫），沒有的話，就像手冊上那樣，配置一系列濃度的洗脫緩沖液，各兩倍體積來洗。
控制好流速，0.5ml/min左右吧，再問問人家一般用多大的流速？兩種洗脫方式各有利弊，梯度洗脫分辨率高一些，操作較簡單，不用頻繁更換緩沖液，但是不太適合批量蛋白的過柱。分布洗脫比較煩，要不停更換緩沖液（換液之前，別忘了關泵，否則柱子要被吸），但是批量操作性好，重復性好，樣品可以不用分步收集，只需把不同濃度緩沖液洗下來的樣品收集到一起即可。
11、 樣品的收集：梯度洗脫的話，將洗脫峰的各管合并（不放心，可以峰前，峰尖，峰尾分別合并，至少可能保證峰尖是純的，不過我覺得你的樣品沒必要這樣，因為本來就比較純的！）分布洗脫的話，本來就是直接按照不同濃度合并收集的，不存在再次合并問題。
12、 樣品純度的檢查：疏水層析后的樣品鹽離子強度很高的一般都，除非你是在0%的時候才洗脫下來你的蛋白（還有，如果你的蛋白0%還洗不下來，可以在洗脫緩沖液中加入5%的乙醇或者乙二醇來洗脫）。不管用什么辦法，請將你的樣品脫鹽（透析，體積太大可以先冷凍干燥再溶解后透析，或者直接用三氯乙酸沉淀洗滌即可）。然后，估計一下你的樣品的蛋白質濃度，就可以SDS-PAGE上樣電泳檢查純度了（測酶活方便的話，比較比酶活也可以初步知道純化程度！）。若純度要求很高，你可以用銀染來檢查，這個靈敏度高，ng級的！
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