流式細胞術間接免疫熒光標記的樣品制備實驗

原理

取一定量的細胞懸液，先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結合抗體，在加入熒光標記的第二抗體，生成抗原-抗體復合物，以流式細胞儀檢測其上標記的熒光素被激發后發出的熒光。

材料與儀器

實驗樣品
抗體、PBS溶液
移液器 移液吸頭 離心機

步驟

一、不同來源樣品的處理

1 . 培養細胞

（1）培養細胞用0.25%的胰酶消化。

（2）PBS或生理鹽水洗滌細胞2次，再用PBS或生理鹽水懸浮細胞，加入預冷的無水乙醇，終濃度為60%——70% ，快速混勻，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。

2. 新鮮標本

（1）將標本切成1——2mm3的小塊。

（2）PBS或生理鹽水清洗后去除上清，加入0.2％膠原酶（或0.15％胰蛋白酶）37℃消化10——30min（根據實驗及不同組織確定），并不斷振動。

（3）300目尼龍篩過濾，除去組織團塊，PBS洗滌2次，300g離心5min，獲得已消化的細胞。

3. 石蠟包埋標本

（1）標本在切片機上切取3——5片50μm厚的組織片。

（2）將切片徹底脫蠟，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸餾水水化。

（3）0.5％胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃消化30min，每隔10min振動1次。

（4）300目尼龍篩過濾，獲得的細胞懸液PBS洗滌2次，300xg離心5min。

注意：脫蠟一定要完全（若加入100％乙醇無絮狀物飄起即可）；切片厚薄適宜，太薄碎片多，影響FCM分析結果，太厚易造成脫蠟不凈；注意掌握消化時間，避免已釋放的細胞被消化。

二、制備

1. 取1×106個細胞/100μl，先加入一抗混勻，置室溫下避光反應30min。

2. 用PBS洗滌細胞2次，離心沉淀棄掉上清液（離心轉數一般為800——1000rpm，5min）。

3. 用100μl PBS重懸細胞，再加入FITC或PE標記熒光二抗（用量均按說明書要求加入）混勻，室溫下反應30min。

4. 用PBS再洗滌細胞2次，加入500μl PBS重懸成單細胞懸液，上機檢測。

注意事項

1. 以上兩種染色方法的抗體加入量和反應時間，一般根據試劑使用說明書的要求進行。若說明書上未說明，應先進行預實驗，掌握好劑量與最佳反應時間后，再進行流式樣品的制備。

2. 制備好的樣品，若不能及時上機檢測，用1%——4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。

常見問題

此法由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。此外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數較少的標本。