接種存活率和克隆形成率法

原理

細胞被制成分散的懸液后，以低密度（2～5 個細胞/cm2）被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群（克隆）的細胞百分數值稱接種存活率，用以表示細胞群的活力。由于檢測接種存活率時是借觀察克隆（通常為16～50 個細胞）形成情況，又因每個克隆都來自一個細胞，因此也稱克隆形成率。細胞接種存活率與細胞活力成正比。

如細胞凍存復蘇后接種再培養時，常測定細胞接種率（Seeding Efficiency），即接種后細胞貼壁數。

細胞接種率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，從而細胞接種率和細胞接種存活率不完全相同。接種存活率在意義上雖與克隆形成率相同，但隆形成率概念更明確。形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞，因此用克隆形成率一詞表示細胞活力更為準確。

克隆形成率與眾多因素相關；從條件來說與底物、培養液、血清的量和質等有關；也受溫度和pH 的影響。從細胞方面，克隆形成率反映細胞的兩個重要性狀，即群體依賴性和增殖能力。一般初代培養細胞弱，傳代細胞系強；二倍體細胞弱，轉化細胞系強；正常細胞弱，腫瘤細胞強。即隨細胞生物學性狀的不同，細胞克隆形成率差別很大；另外所有細胞的克隆形成率又受接種細胞密度的影響。

材料與儀器

細胞
醋酸甲醇 Giemsa 瓊脂 DME
玻璃 塑料板 CO2溫箱

步驟

一、凍存技術不良或細胞生活力弱時可降低接種存活率
為獲得確切的接種存活率，接種時一定要接種分散為單細胞懸液。一般情況下把細胞直接接種在碟皿中即可。細胞接種密度和克隆形成率有一定關系。做克隆率測定時，一般持續一周，期間隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養，固定染色。

1.  細胞
80 %～90 %匯合細胞；

2.  懸液制備
用消化法制備成單細胞懸液，接種到適宜底物（玻璃或塑料瓶皿）；用多孔塑料板亦可（每孔底面積不宜小于1mm2）；

3.  培養
置溫箱中培養；

4.  觀察
隔48～96 小時，見細胞克隆已形成，終止培養；1：3 醋酸甲醇固定、Giemsa染色、鏡下觀察、計算克隆數。

二、軟瓊脂培養
特別是雙層軟瓊脂培養，仍為當前檢測轉化細胞和腫瘤細胞最為常用的方法，與細胞惡性程度有很大的符合率。

1.  瓊脂制備
用三蒸餾水分別制備出1.2 %和0.7 %兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40 ℃中勿令凝固；

2.  無菌制備出2xDME（含有2x抗生康和20%的小牛血清），保存在37 ℃中；

3.  底層瓊脂制備
按1：1混合1.2 %的瓊脂糖和2×DME后，取3 ml 混合液注入直徑6 cm平皿中（如為10 cm平皿則加7～10 ml），令冷卻凝固、置CO2溫箱中備用；

4.  消化細胞
用營養液制成細胞懸液、計數；

5.  頂層瓊脂制備
按1：1 比例讓0.7 %瓊脂和2xDME在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2 ml的細胞懸液，充分混均、注入已鋪有1.2 %瓊脂糖底層平皿中（直徑6 cm 平皿加3 ml；10 cm平皿加7～10 ml），遂形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37 ℃CO2溫箱中，培養10 天～14 天；

6.  觀察細胞集落。

注意事項

1.  確定克隆無絕對標準，一般情況下不能少于8 或10 個以上的細胞群才算作一個克隆；克隆檢測宜用低倍鏡，用解剖鏡檢查甚好。

2.  制備細胞懸液要求一定做到為單細胞，如分散不好，有很多兩個以上的細胞團，接種后可導致克隆形成不均，將出現人為誤差。

3.  接種密度不能過大，在細胞過密情況下，細胞克隆相互界限不清或易發生早期匯合。

4.  瓊脂與細胞相混時，溫度不宜超過40 ℃以免燙傷細胞。
5.  接種細胞密度每平方厘米最好不超過35 個；在直徑6 cm的平皿應接種細胞1000 個。

6.  上層瓊脂中含有細胞，因瓊脂為半流體，細胞懸于瓊脂中不下沉；如分散和混合良好，則細胞被均勻互相隔離；因兩層瓊脂中都含有DME，細胞可獲充分營養進行增殖生長。

7.  由于細胞被相互隔離，孤立存在，消除了細胞相互影響，對細胞依存性大的細胞增殖生長不利；腫瘤細胞獨立生存性強，仍能形成克隆。