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RT-PCR實驗步驟

一、組織抽提：

1. 取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末

2. 移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿

3. 移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打

4. 冰上孵育5分鐘

5. 離心12,000g 4℃ 5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管

6. 加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘

7. 離心<12,000g 4℃ 10分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管

8. 加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘

9. 離心<12,000g 4℃ 5分鐘 棄去上清液

10. 加入1 ml 75%乙醇，震蕩

11. 離心<7,500g 4℃ 5分鐘 棄去上清液

12. 室溫下使之變透明

13. 加入DEPC處理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低溫冰箱）

14. 走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計檢測260/280吸光度比值，計算RNA濃度

二、RT反應體系（第一步）：約20分鐘

RNA 抽提物

5μl

Radome 引物

2μl

RNA sin

0.5μl

1. 65℃ 15分鐘

2. 立即放入冰浴

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