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基因突變檢測(cè)技術(shù)
發(fā)布日期:2022-06-30 10:40:18


基因突變檢測(cè)技術(shù)


對(duì)未知突變進(jìn)行分析的方法


1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage)


在一定條件下,異源雙鏈核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的錯(cuò)配堿基可被RNaseA切割,切割產(chǎn)物可通過跑變性膠得到分離。RNA探針可通過將相應(yīng)的DNA片段克隆至含有SP6或T7啟動(dòng)子的載體中得到,當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤時(shí),RNaseA在錯(cuò)配處的切割效率很低甚至不切割,而當(dāng)錯(cuò)配堿基為嘧啶時(shí),則其切割效率較高。所以如果僅分析被檢DNA的一條鏈,其突變檢出率只有30%,而如果同時(shí)分析被檢DNA的正義鏈和反義鏈,則有效率可達(dá)到70%[1]。盡管RNaseA切割法有其局限性,如需使用同位素,需將PCR產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體上,從而增加了操作的復(fù)雜度,但由于它能對(duì)1~2kb的片段進(jìn)行檢測(cè),并能確定突變位置,且無需使用有害化學(xué)試劑,故仍被頻繁使用。


2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)


該方法的原理是:雙鏈DNA分子在一定變性劑濃度的凝膠上電泳時(shí),會(huì)在一定的時(shí)間發(fā)生部分解鏈,導(dǎo)致電泳遷移率下降,當(dāng)正常的DNA分子和發(fā)生突主的DNA分子之間即使只有一個(gè)堿基對(duì)的差異時(shí),也會(huì)在不同時(shí)間發(fā)生部分解鏈,從而被分離成兩條


3. 雜合雙鏈分析法(HA)


由突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一個(gè)凸起,在非變性膠中電泳時(shí),會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率,從而使兩者被分離開。該方法原理與單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)相似,只不過SS-CP分離的是單鏈,而HA法分離的是雙鏈。HA法簡(jiǎn)單迅速,但只適用于200~300pb的片段,且不能確定突變位置,檢出率只有80%左右,有人建議將HA法和SSCP法聯(lián)合使用,可能將檢出率提高到接近100%[4],也有科研工作者建議使用缺失的野生型等位基因來提高該方法的靈敏度


4. 化學(xué)切割錯(cuò)配(CCM)


化學(xué)切割錯(cuò)配是在Maxam-Gilbert測(cè)序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)突變檢測(cè)技術(shù),在DNA∶DNA或DNA∶RNA異源雜合雙鏈核酸分子中,錯(cuò)配的C能被羥胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,錯(cuò)配的T能被四氧化鋨(Osmiumtetroxide)所切割,切割產(chǎn)物跑變性膠電泳即可確定是否存在突變。


只要操作得當(dāng),不會(huì)發(fā)生非特異性切割,如果對(duì)正義鏈和反義鏈都進(jìn)行分析,可使檢出率達(dá)到100%;使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)將會(huì)大大增強(qiáng)該方法的靈敏度,從而可檢測(cè)出十個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)突變細(xì)胞[7]。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是能對(duì)長(zhǎng)至2kb的片段分析,并能確定突變位置,缺點(diǎn)是步驟多,費(fèi)時(shí),且需接觸有毒的化學(xué)物質(zhì)。


5.碳化二亞胺檢測(cè)(Carbodiimide,CDI)


與CCM法相似,CDI能夠?qū)﹀e(cuò)配的G和T進(jìn)行修飾,當(dāng)用標(biāo)記的引物對(duì)CDI修飾過的雙鏈DNA進(jìn)行DNA合成時(shí),延伸會(huì)在修飾過的堿基處終止下來,合成產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳即可檢測(cè)出是否有突變。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)也是能對(duì)1~2kb的片段進(jìn)行分析,突變檢出率達(dá)到100%,能確定突變位置,并且CDI是一種沒有毒性的物質(zhì),有報(bào)道曾用該法檢測(cè)出了7.2kbDNA片段中的一個(gè)點(diǎn)突變,但當(dāng)一個(gè)DNA片段中存在多個(gè)突變時(shí),該方法就不適用。


6.酶促切割錯(cuò)配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)  


EMC是一種與RNaseA切割相類似的方法,T4核酸內(nèi)切酶 是一種分解酶(resolvase),能夠識(shí)別12種錯(cuò)配的堿基并在錯(cuò)配堿基的附近進(jìn)行切割,酶切產(chǎn)物跑變性膠或中性膠即可檢測(cè)出是否有突變[9],電泳產(chǎn)物的檢測(cè)可用放射自顯影,也可用銀染。由于該法能對(duì)DNA∶DNA異源雜合分子進(jìn)行分析,因而省去了體外轉(zhuǎn)錄的步驟,其最長(zhǎng)檢測(cè)片段可達(dá)到1.5kb,該法的缺點(diǎn)是存在非特異性切割現(xiàn)象,并且對(duì)有些錯(cuò)配堿基的識(shí)別不是100%,因此在每次檢測(cè)時(shí)都必須設(shè)有一個(gè)內(nèi)對(duì)照。


7.單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandCon-formationalPolymorphism,SSCP)


該方法的原理是[10]:單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu),這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成,即使是一個(gè)堿基的不同,也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)并引起在非變性電泳條件不同的電泳遷移率


8.切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性


(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技術(shù)是在限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)和SSCP基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種基因突變檢測(cè)技術(shù),其原理是:雙鏈DNA變性后形成的單鏈在中性條件下形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(包含多個(gè)折疊的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)),正如SSCP一樣,這種二級(jí)結(jié)構(gòu)取決于DNA的核苷酸組成和順序,即使有一個(gè)堿基的差異,也會(huì)形成不同數(shù)目的折疊狀發(fā)夾結(jié)構(gòu),而CleavaseI外切酶能識(shí)別這種發(fā)夾結(jié)構(gòu),并在該結(jié)構(gòu)的附近進(jìn)行切割,切割產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè),突變的DNA將出現(xiàn)與正常對(duì)照不同的酶切圖譜


9.DNA測(cè)序(Sequencing)


由各種突變檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到的突變最后都得由測(cè)序來確定突變類型及突變位置,而且測(cè)序法檢測(cè)突變的效率達(dá)到100%,基于此,有科研工作者提出對(duì)一些比較小,外顯子比較少的基因的突變檢測(cè)直接用測(cè)序來進(jìn)行,如CMTX的CX32基因的突變分析[16],但該方法需要較多的勞力,且需接觸同位素,由PEABD公司推出的DNA自動(dòng)測(cè)序儀使用四色熒光標(biāo)記代替了原來手工測(cè)序的同位素標(biāo)記,并且測(cè)序和分析數(shù)據(jù)的時(shí)間也大大縮短,但缺點(diǎn)是花費(fèi)昂貴,所以對(duì)一些較大的,外顯子較多的基因不宜用測(cè)序法直接檢測(cè)突變,同時(shí)也不適用于臨床對(duì)大量的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),此外,測(cè)序也不能被當(dāng)成是突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測(cè)序獲得精確的數(shù)據(jù)。


10.雙脫氧指紋圖譜法(DideoxyFinger-printing,ddF)


由于SSCP檢測(cè)方法的靈敏度受到電泳溫度、PCR片段大小等因素的影響,而直接DNA測(cè)序的方法又費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢,因此有研究工作者在實(shí)際應(yīng)用中將SSCP和Sanger雙脫氧測(cè)序法結(jié)合起來形成一種新的突變檢測(cè)方法,即ddF[16]。該方法的基因原理是:將PCR產(chǎn)物回收純化后用兩個(gè)引物分別做Sanger雙脫氧測(cè)序反應(yīng),但不同的是僅加入一種雙脫氧終止劑,反應(yīng)產(chǎn)物跑中性聚丙烯酰胺凝膠電泳如果確有突變的話,在病人的電泳圖譜上將會(huì)丟失或獲得一條帶或者至少有一條帶的遷移率會(huì)發(fā)生改變。在ddF方法中,DNA鏈的遷移率不僅取決于其二級(jí)結(jié)構(gòu),而且與其大小相關(guān),因而較SS-CP法更為靈敏。


MartincicD等曾經(jīng)將SSCP法和ddF法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)ddF能將10種已知的p53抑瘤基因突變?nèi)繖z測(cè)出來,而SSCP法只能檢測(cè)到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測(cè)到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測(cè)的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度也能達(dá)到近500bp,并且該法還能對(duì)突變位置進(jìn)行相對(duì)定位。該法的主要缺點(diǎn)是需要使用同位素,同時(shí)對(duì)回收的PCR產(chǎn)物純度要求較高,非特異的PCR產(chǎn)物將嚴(yán)重影響到最后結(jié)果的分析。


11.錯(cuò)配接合蛋白檢測(cè)


從Ecoli中分離的一種DNA錯(cuò)配接合蛋白能在異源雜合雙鏈DNA中的錯(cuò)配堿基處接合DNA,接合后的產(chǎn)物跑測(cè)序膠,可通過電泳遷移率的改變檢測(cè)是否有突變[17]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,可一次處理大量的樣品,但據(jù)報(bào)道這種DNA錯(cuò)配接合蛋白對(duì)單堿基錯(cuò)配的接合程度不如對(duì)幾個(gè)堿基錯(cuò)配的接合那么強(qiáng),并且這種蛋白對(duì)非錯(cuò)配區(qū)也有一定的結(jié)合從而導(dǎo)致背景增高,最近有研究工作者建議將幾種DNA錯(cuò)配接合蛋白聯(lián)合起來使用將會(huì)提高突變檢測(cè)的準(zhǔn)確率[18],但總的來說該方法有待于進(jìn)一步發(fā)展。


12.變性的高效液相色譜檢測(cè)(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)


DHPLC技術(shù)是一項(xiàng)在SSCP和DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的雜合雙鏈突變檢測(cè)技術(shù),其原理與DGE類似,即通過HPLC在部分變性的條件下可將發(fā)生錯(cuò)配的異源雜合雙鏈DNA和完全匹配的同源雙鏈DNA分離開來[21]。DHPLC技術(shù)曾被用來進(jìn)行比較DNA測(cè)序[22],目前在Stanford的一個(gè)研究小組正在利用該技術(shù)檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因突變。與傳統(tǒng)的雜合雙鏈分析技術(shù)相比較,該技術(shù)花時(shí)短,分析一個(gè)樣品一般僅需5分鐘,不需使用放射性同位素,自動(dòng)化程度高,但是需要另處購買一臺(tái)HPLC儀器。雖然目前該技術(shù)主要用來檢測(cè)200~300bp大小的DNA片段,長(zhǎng)的DNA片段的檢測(cè)尚未見報(bào)道,但研究工作者對(duì)此持樂觀態(tài)度。


13.DNA芯片技術(shù)(DNAchip)


DNA芯片技術(shù)是90年代以來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),該技術(shù)結(jié)合了集成電路計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、激光共聚集掃描,熒光標(biāo)記探針和寡核苷酸DNA合成等技術(shù),充分體現(xiàn)了生物學(xué)技術(shù)與其它重要的作用,如基因定位,DNA測(cè)序,物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等,同樣,在基因突變檢測(cè)方法,DNA芯片技術(shù)的前景也令人鼓舞,其基本原理是:許多已知順序的寡核苷酸DNA被排列在一塊集成電路板上,彼此之間重疊一個(gè)堿基,并覆蓋整個(gè)所需檢測(cè)的基因,熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA分別與兩塊DNA芯片雜交,由于至少存在一個(gè)堿基的差異,正常DNA和突變DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜,通過共聚焦顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)即可確定是否存在突變。






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