理性和半理性改造大腸桿菌工程化生產(chǎn)水楊酸

通訊作者：Jing Wu

發(fā)表雜志：ACS Synthetic Biology

發(fā)表時(shí)間：2024.7.17

DOI：10.1021/acssynbio.4c00366

研究背景：

   水楊酸（SA）是一種有效的生物活性有機(jī)酸，可以在植物中進(jìn)行自然生物合成，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有多種應(yīng)用工程微生物生產(chǎn)水楊酸可以有效減少環(huán)境污染，為水楊酸生物合成提供綠色、可持續(xù)的替代方案。但是關(guān)鍵酶的低催化效率和水楊酸對(duì)細(xì)胞的固有毒性給大規(guī)模微生物生產(chǎn)帶來了重大挑戰(zhàn)。

研究?jī)?nèi)容：

   這項(xiàng)研究選擇實(shí)驗(yàn)室的一株高產(chǎn)L-苯丙氨酸菌株作為出發(fā)菌株，首先引入水楊酸合成酶Irp9并敲除編碼分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶的pheA/tyrA基因，水楊酸提高6.8倍。然后選擇Trc強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)化Irp9的表達(dá)，ppsA基因的天然啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟動(dòng)子J23119，增加tktA基因（編碼轉(zhuǎn)酮醇酶1）的拷貝數(shù)，水楊酸的產(chǎn)量增加到2.08 g/L。再者得到了Irp9的晶體模型，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬等蛋白質(zhì)工程分析出突變位點(diǎn)，通過非理性突變構(gòu)建了24個(gè)氨基酸位置的飽和突變庫(kù)，篩選了對(duì)Irp9活性有顯著影響的關(guān)鍵氨基酸位置，最終，搖瓶發(fā)酵48小時(shí)后，水楊酸的滴度達(dá)到2.67 g/L。最后通過將適應(yīng)性進(jìn)化與轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合篩選確定的mdtN、mraZ和yhfL等有益基因組合過表達(dá)，菌株死亡率下降，搖瓶發(fā)酵檢測(cè)到水楊酸的產(chǎn)量為3.72 g/L。

總結(jié)：

   這項(xiàng)研究首先將水楊酸合成酶Irp9引入產(chǎn)生L-苯丙氨酸的大腸桿菌中，構(gòu)建了最短的水楊酸生物合成途徑。后續(xù)的蛋白質(zhì)工程將Irp9的催化效率提高了33.5%。

   此外，通過將適應(yīng)性進(jìn)化與轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合，闡明了外排蛋白在水楊酸耐受中的關(guān)鍵機(jī)制。這一機(jī)制的闡明指導(dǎo)我們對(duì)這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行靶向修飾，在搖瓶中實(shí)現(xiàn)了已報(bào)道的水楊酸的最高水平3.72 g/L。本研究強(qiáng)調(diào)了外排蛋白對(duì)于提高微生物細(xì)胞工廠在水楊酸生產(chǎn)中的生產(chǎn)力的重要性，這也在其他酚酸的綠色合成中具有應(yīng)用潛力。