實時熒光定量PCR原理
所謂實時熒光定量PCR 技術(shù)，是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
1. 在熒光定量PCR 技術(shù)中，有一個很重要的概念—— Ct 值。C 代表Cycle ，t 代表threshold ，Ct 值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
2. 熒光域值（threshold ）的設(shè)定
PCR 反應(yīng)的前15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10 倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
3. Ct 值與起始模板的關(guān)系
研究表明，每個模板的Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
4. 熒光化學
熒光定量PCR 所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1 ）TaqMan 熒光探針：PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR 擴增時，Taq 酶的5 ’ －3 ’ 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR 產(chǎn)物形成完全同步。
2 ）SYBR 熒光染料：
在PCR 反應(yīng)體系中，加入過量SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地摻入DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。
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