血清γ—球蛋白的提純
【原理】
應用不同濃度硫酸銨分段鹽析法將血清中γ—球蛋白與白蛋白及α、β球蛋白分離，最后用透析法或凝膠過濾法除去，即可得到比較純的γ—球蛋白。
【操作】
一、鹽析：
1． 取離心管一支加入血清1mL，加入等量PBS稀釋血清，搖勻后逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL，邊加邊搖，然后靜置10分鐘，再離心（4000轉/分）15分鐘，將上清液（主要含清蛋白）傾入試管中（留供后面實驗用）。
2．離心管底部的沉淀用PBS緩沖液0.5mL攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨0.25mL（相當于33%飽和硫酸銨），搖勻后再放置10分鐘，離心（4000轉/分）15分鐘，傾棄上清液（主要含α、β球蛋白），其沉淀即為初步純化的γ—球蛋白。（如要得更純的γ—球蛋白，可重復這步鹽析過程2次）。
二、脫鹽：
1．裝柱：稱取葡聚糖凝膠G-250 1g，放入100mL燒杯內加入蒸餾水約500mL，用小火煮沸1小時（注意：隨時補充蒸餾水，以免干）靜置冷卻后傾棄上層蒸餾水，再加入PBS緩沖液10mL，將杯內的凝膠用玻璃棒輕輕攪拌使之懸起，傾入有少量玻璃棉（或尼龍布）堵住下口的20×1cm層析柱內，層析柱下口套一小段橡皮管。
待全部凝膠傾入柱內（注意：凝膠要裝填均勻，若分多次加入凝膠應在放膠前將柱內凝膠頂部攪動懸起，再將凝膠液傾入），且液面始終高于凝膠面，用螺旋夾調節PBS緩沖液的流速，控制在每分鐘6滴，注意陸續不斷的加入PBS緩沖液，不要使液面低于凝膠面。
2．脫鹽：在盛有γ—球蛋白沉淀物的離心管內，加入PBS緩沖液5滴，并用玻璃棒輕輕攪拌，至全部沉淀物溶解后用滴管吸出γ—球蛋液，將滴管插入凝膠層析柱內，管口靠近凝膠面緩慢滴入3滴蛋白質液，待全部蛋白質液進入凝膠層后，用滴管輕輕靠近凝膠面加入PBS緩沖液30滴（注意：不要攪動凝膠面），待大部分液體流入凝膠柱后，再陸續小心加入PBS緩沖液5~10mL，不要使液面低于凝膠面。洗脫流速始終控制在6滴/分。
3．收集：棄50滴后，用干凈的小試管，編號每管收集凝膠柱洗脫液10滴，分別進行檢測。
4．檢測：準備干凈的反應板兩塊，每塊反應板各孔依次各加入各管收集的液體1滴，然后在一塊反應板每孔再加入奈氏 試劑 1滴，（檢查NH4+存在，呈黃色到橙色），記錄下各孔的顏色變化。另一塊反應板每孔各加入雙縮脲 試劑 1滴，觀察雙縮脲反應的呈色深淺，用（－）、（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）表示。將呈色最深的孔所對應的管內液體留供濃縮實驗用。
以上操作可參照操作簡介進行。
【操作簡介】
待緩沖液全部進入層析柱，用長滴管吸取γ—球蛋白溶液（棄泡沫），管口靠近凝膠面緩慢滴入γ—球蛋白溶液4滴，待溶液進入層析床面后，加入PBS緩沖液3滴，待再進入床面后，再加入PBS緩沖液30滴；層析柱下棄洗脫液50滴。再用干凈小 試管 ，每管收集洗脫液10滴。直到洗脫液和奈氏試劑反應無色，擰緊螺旋夾。
檢測：一塊反應板每孔加雙縮脲試劑1滴，檢測蛋白質，另一塊反應板每孔加奈氏試劑1滴，檢測NH 4 ＋ 。
一、透析和濃縮
取玻璃紙（15×15cm）一張，折成袋狀。將前面第一次鹽析得到的含清蛋白上清液傾入袋內，用線繩縛緊上口，用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內，使透析袋下部浸入水中。將杯放置1小時以上，（中間換水1~2次），然后將透析袋取下，小心將線繩解開，用滴管吸出袋內液體放入干凈 試管 中，用雙縮脲法分別檢查袋內液體有無蛋白質。再用奈氏試劑檢查袋外（燒杯中）液體的NH4＋，觀察透析法除鹽的效果，這種方法亦用于其他蛋白質（如γ—球蛋白）的脫鹽。
另取玻璃紙一張，同上法將前面凝膠過濾除鹽得到的γ—球蛋白溶液放入透析袋內，懸于盛有10mL濃蔗糖或聚乙醇溶液的小燒杯內，同樣放置1小時以上，觀察袋內液體體積的變化，小心收集袋內液體入小瓶內，置冰箱保存供以后實驗用。
【試劑】
1． 免疫 血清
2． PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水——用0.1M磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）配制的0.9%NaCl溶液。
3． pH7.2飽和硫酸銨溶液——用濃氨水將飽和硫酸銨溶液調pH至7.2。
4． 葡聚糖凝膠G-250。
5． 奈氏試劑：
（1）貯備液：取碘化鉀150g、碘110g、水100mL，移入250mL錐形瓶中，再加汞150g，分別搖蕩10~15分鐘，至碘完全溶解，此時溶液溫度逐漸升高，由紅色變為淺棕色，將錐形瓶置于流水下冷卻，繼續搖蕩，至溶液為米黃色為止，傾入溶液置2000mL 容量瓶 中，將沉淀用水多次洗滌傾入瓶中，然后加水至2000mL刻度，混勻。
（2）應用液：倒上述溶液30mL，加入10%NaOH140mL，加水30mL混勻，即為奈氏試劑（奈氏試劑的主要成分是碘化鉀汞復鹽）
堿度要求：20mL1MHCl消耗奈氏試劑11~11.5mL。
6． 雙縮脲試劑：
硫酸銅250g加水100mL，加熱助溶，取酒石酸鉀鈉10g、碘化鉀5g溶于500mL水中，再加20%NaOH30mL，混勻，然后將硫酸銅溶液傾入，加水至1000mL。
7．濃蔗糖溶液——飽和蔗糖溶液。
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