水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定——離效液相色譜法
3 離效液相色譜法
3.1 原理
試樣中的殘留物用乙腈-乙酸鹽緩沖混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷層并濃縮，經(jīng)酸性氧化鋁柱凈化后，高效液相色譜-二氧化鉛柱后衍生測(cè)定，外標(biāo)法定量。
3.2 試劑和材料
除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為重蒸餾水。
3.2.1 乙腈：液相色譜純。
3.2.2 二氯甲烷。
3.2.3 甲醇：液相色譜純。
3.2.4 乙酸鹽緩沖液：溶解4.95g無水乙酸鈉及0.95g對(duì)-甲苯磺酸于950mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH到4.5，最后用水稀釋到1L。
3.2.5 20%鹽酸羥胺溶液。
3.2.6 1.0mol/L對(duì)-甲苯磺酸：稱取17.2g對(duì)-甲苯磺酸，并用水稀釋至100mL。
3.2.7 50mmol/L乙酸銨緩沖溶液：稱取3.85g無水乙酸銨溶解于1000mL水中，冰乙酸調(diào)pH到4.5。
3.2.8 二甘醇。
3.2.9 酸性氧化鋁：80目?120目。
3.2.10 二氧化鉛。
3.2.11 硅藻土545：色譜層析級(jí)。
3.2.12 標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、結(jié)晶紫（CV）、隱色結(jié)晶紫（LCV），純度大于98%。
3.2.13 標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫，用乙腈分別配制成100Mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用乙腈稀釋配制1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。一18°C避光保存。
3.2.14 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫均為20ng的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。一18°C避光保存。
3.3 儀器和設(shè)備
3.3.1 高效液相色譜儀：配有紫外-可見光檢測(cè)器。
3.3.2 勻漿機(jī)。
3.3.3 離心機(jī)：4000r/min。
3.3.4 固相萃取裝置。
3.3.5 25%二氧化鉛氧化柱：不銹鋼預(yù)柱管［5cmX4mm（內(nèi)徑）］，兩端附2μm過濾板，抽真空下，填裝含有25%二氧化鉛的硅藻土，添加數(shù)滴甲醇?jí)簩?shí)，旋緊。臨用前用甲醇沖洗。并將二氧化鉛氧化柱連接在紫外-可見光檢測(cè)器與液相色譜柱之間。
3.3.6 酸性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
3.4 樣品制備
3.4.1 提取
稱取5.00g樣品于50mL離心管內(nèi)，加入1.5mL20%的鹽酸羥胺溶液，2.5mL1.0mol/L的對(duì)-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸鹽緩沖溶液，用勻漿機(jī)以10000r/min的速度均質(zhì)30s，加入10mL乙腈劇烈振搖30s。加入5g酸性氧化鋁，再次振蕩30s。3000r/min離心10mm。把上清液轉(zhuǎn)移至裝有10mL水和2mL二甘醇的100mL離心管中。然后在50mL離心管中加入10mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并乙腈層。
3.4.2 凈化
在離心管中加入15mL二氯甲烷，振蕩10s，3000r/min離心10min，將二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重復(fù)上述操作一次，合并二氯甲烷層于100mL梨形瓶中。45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1mL，用2.5mL乙腈溶解殘?jiān)?/span>
將酸性氧化鋁柱（3.3.6）安裝在固相萃取裝置上，將梨形瓶中的溶液轉(zhuǎn)移到柱上，再用乙腈洗滌瓶2次，每次2.5mL，把洗滌液依次通過柱，控制流速不超過0.6mL/min，收集全部流出液，45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘液準(zhǔn)確用0.5mL乙腈溶解，過0.45濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。
3.5 測(cè)定
3.5.1 液相色譜條件
a） 色譜柱：C18柱，250mmX4.6mm（內(nèi)徑），粒度5μm，在C18色譜柱和檢測(cè)器之間連接25%二氧化鉛氧化柱；
b） 流動(dòng)相：乙腈和乙酸銨緩沖溶液（3.2.7），梯度洗脫參數(shù)見表1；
c） 流速：1.0mL/min；
d） 柱溫：室溫；
e） 檢測(cè)波長(zhǎng)：618nm（孔雀石綠），588nm（結(jié)晶紫）；
f） 進(jìn)樣量：50μL。
3.5.2 液相色譜測(cè)定
根據(jù)樣液中被測(cè)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫或隱色結(jié)晶紫含量情況，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。在上述色譜條件下，孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫的保留時(shí)間約為6.10min，7.88min、17.77min、18.22min，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖參見附錄A中圖A.2。
3.6 空白試驗(yàn)
除不加試樣外，均按3.4，3.5步驟進(jìn)行。
3.7 結(jié)果計(jì)算和表述
按式（2）計(jì)算樣品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫殘留量。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。
式中：
X——樣品中待測(cè)組分殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
c—待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL)；
A——樣品中待測(cè)組分的峰面積；
As——待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰面積；
V——樣液最終定容體積，單位為毫升(mL)；
m——最終樣液所代表的試樣量，單位為克(g)。
本方法孔雀石綠的殘留量測(cè)定結(jié)果系指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量之和，以孔雀石綠表示。
本方法結(jié)晶紫的殘留量測(cè)定結(jié)果系指結(jié)晶紫和它的代謝物隱色結(jié)晶紫殘留量之和，以結(jié)晶紫表示。
3.8 方法檢測(cè)限
本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的檢測(cè)限均為2.0μg/kg。
文章來源：《水產(chǎn)品獸藥殘留限量及監(jiān)測(cè)方法查詢手冊(cè)》
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