微生物實驗室菌液有效期驗證

2025版中國藥典實施后，培養基適用性要求提高，菌種使用量會增加很多，有的公司會開始做菌液有效期驗證，來節約人力、時間和成本，現將微生物菌液有效期的方案分享出來，希望有幫助。菌液日常使用時，建議分裝后使用。

1.驗證目的

驗證微生物實驗室菌液在2～8℃貯藏條件下保存的期限。

2.驗證范圍

適用于微生物實驗室的金黃色葡萄球菌（Sa）、大腸埃希菌（Ec）、枯草芽孢桿菌（Bs）、銅綠假單胞菌（Pa）、白色念珠菌（Ca）、黑曲霉（An）、乙型副傷寒沙門菌（Sp）的菌液及枯草芽孢桿菌芽孢液（Bss）效期驗證。

3.驗證依據

《中國藥典》四部    

4.驗證標準

5.驗證條件

5.1 相關人員培訓

本方案應在批準執行后、確認實施前進行培訓。

5.2 常見培養基中文名稱及縮寫

5.3 驗證菌液信息

5.4 儀器設備

5.5試劑耗材

6試驗內容

6.1試劑配制

6.1.1  如無特殊說明，所有溶液均使用純化水（自制）配制。

6.1.2   培養基（含試液）配制參考其相應說明書操作。

6.1.3    pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：

6.2菌液制備

6.2.1取出菌種保存管，置室溫放置30min。將外表面擦拭干凈并消毒，無菌開啟凍存管，將內容物移至適宜的培養基上培養。接種金黃色葡萄球菌（Sa）、大腸埃希菌（Ec）、枯草芽孢桿菌（Bs）、銅綠假單胞菌（Pa）至胰酪大豆胨液體培養基（TSB）中，30～35℃培養18～24小時；接種白色念珠菌至胰酪大豆胨液體培養基（TSB）中，20～25℃培養2~3天。培養結束后為菌液。

6.2.2接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）斜面上，20～25℃培養5～7天或直到獲得豐富的孢子，加入3～5ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，制成黑曲霉孢子菌液。

6.3枯草芽孢桿菌（Bs）芽孢液制備

6.3.1芽孢液

6.3.1.1取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細吸管吸加適量TSB培養基，輕柔吹吸數次，使菌種融化分散。取含5 ml～10mlTSB培養基試管，滴入少許菌種懸液，置36℃培養18h～24h。用接種環取第1代培養的菌懸液，劃線接種于TSA培養基平板上，于36℃培養18h～24h。挑取上述第2 代培養物中典型菌落，接種于TSB培養基，于37℃培養18h～24h，即為第3 代培養物。

6.3.1.2用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml第3代～5代的18h～24h TSB培養物，接種于試管中TSA培養基表面，將其搖動使菌液布滿TSA培養基的表面，再將多余肉湯培養物吸出，將試管置于36℃溫箱內，培養5d～7d。

6.3.1.3用接種環取菌樣少許涂于玻片上，固定后以染色法染色，并在顯微鏡（油鏡）下進行鏡檢。當芽孢形成率達95% 以上時，即可進行以下處理。否則，應繼續在培養箱下放置一定時間，直至達到上述芽孢形成率后再進行以下處理。

6.3.1.4試管培養物，用10.0ml 吸管加10.0ml無菌純化水于每一試管中，以L棒輕輕推刮

下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向管內吸加5.0ml無菌純化水，重復洗菌一遍。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。

6.3.1.5必要時，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置45℃水浴中24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽孢。

6.3.1.6用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝塊。

6.3.1.7將過濾后的芽孢懸液，置無菌離心管內，以3000 r/min 速度離心30min。棄上清液，

加純化水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，先后共3遍。

6.3.1.8將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶內純化水中，并加入適量小玻璃珠。

6.3.2將芽孢液放于80℃水浴中10min（或60℃，30min），以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。

6.3.3芽孢懸液在使用時，應先進行活菌培養計數。

6.4菌液的保存及貯藏時間

將制備好的菌液及芽孢液混勻后分裝后保存于2~8℃。驗證時間初步定為0天、7天、14天、21天、31天、38天，實際驗證時間可做適當變動，但驗證總天數不小于38天，已驗證合格的最長天數減去7天作為最終確認的有效期時間。

6.5菌液計數

6.5.1金黃色葡萄球菌（Sa）、大腸埃希菌（Ec）、枯草芽孢桿菌（Bs）、銅綠假單胞菌（Pa）、白色念珠菌（Ca）、乙型副傷寒沙門菌（Sp）及枯草芽孢桿菌芽孢液（Bss）效期的菌液，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液按10倍系列稀釋制成適宜濃度的菌懸液。黑曲霉（An）的菌液吸出至無菌試管內，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，按10倍系列稀釋制成適宜濃度的孢子懸液。用胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）使用涂布法計數。結果寫在附件一微生物實驗室菌液保存有效期驗證記錄上。  

6.5.2TSA上菌種的形態

6.5.3菌種在TSA和XLD上典型形態圖

6.6結論

7再驗證

當發現在貯藏有效期內菌液活菌數明顯減少或影響菌液使用時需重新驗證。

8        偏差

記錄本方案實施過程中所發生的偏差。

以上方案實施過程中是否存在偏差：□是□否

9附件                  

附件一微生物實驗室菌液保存有效期驗證記錄______(日期)（可復制后使用）

10 關聯記錄

11 修訂歷史

12 附件一微生物實驗室菌液保存有效期驗證記錄___________（日期）（可復制后使用）

1. 檢驗設備：

2.實驗試劑耗材：

3.菌種信息：

4.實驗操作：

4.1. 培養及環境條件

4.2. 測試過程

4.2.1.菌液配制：將菌液和芽孢液配制成指定濃度（菌懸液在每級稀釋前渦旋30s，加至無菌碟中或涂布前渦旋10s使用）。

4.2.2.以無菌操作方式吸取___ml經適當稀釋的菌懸液滴加至培養基平板上，然后用涂布棒將菌液均勻涂抹于培養基表面，制備兩份，待液體被瓊脂吸收后倒置于相應的培養箱中培養。

4.2.3.30-35℃培養不超過3天，20-25℃不超過5天，至沒有新增計數結果時候取出。

5. 菌落形態特征：

6.實驗結果：