堿性蛋白酶活力測定
【實驗目的】
1. 掌握測定堿性蛋白酶活力的原理和酶活力的計算方法。
2. 學習測定酶促反應速度的方法和基本操作。
【實驗原理】
酶活力是指酶催化某些化學反應的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學反應的速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學反應的速度。
酶促反應的速度可以用單位時間內反應底物的減少量或產物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內產物的生成量。由于酶促反應速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應的初速度。
堿性蛋白酶在堿性條件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑 （磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）發生福林酚反應。
（福林酚反應：福林試劑 在堿性條件下極其不穩定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用堿性蛋白酶在單位時間內水解酪蛋白產生的酪氨酸的量來表示酶活力。
【實驗材料】
1.實驗器材
電熱恒溫水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度計
2.實驗試劑
(1)福林試劑：在1L容積的磨口回流瓶中加入50g鎢酸鈉(Na 2 WO 4 ·2H 2 O)、125g鉬酸鈉(Na 2 MoO 4 ·2H 2 O)、350ml蒸餾水、25ml 85％磷酸及50ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h。
回流完畢，再加25g硫酸鋰、25ml蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰15分鐘，以便驅除過量的溴，冷卻后定容到500ml。過濾，置于棕色瓶中暗處保存。使用前加4倍蒸餾水稀釋。
(2)1%酪蛋白溶液：稱取酪蛋白1克于研缽中，先用少量蒸餾水濕潤后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸餾水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分鐘，溶解后冷卻，定容至100ml，保存于冰箱內。
(3)pH10緩沖溶液：
甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O) 19克，用蒸餾水溶解并定容至1000ml 。
乙液：0.2mol/L氫氧化鈉溶液
配制pH10硼砂氫氧化鈉溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml，用蒸餾水定容至200ml。
(4)標準酪氨酸溶液：精確稱取酪氨酸50mg，加入1ml 1mol/L鹽酸溶解后用蒸餾水定容至50ml，即得1mg/ml酪氨酸標準溶液。
(5)0.4mol/L碳酸鈉溶液,0.4mol/L三氯醋酸溶液。
【實驗操作】
1.制備酪氨酸標準曲線
(1) 取7支 試管 ，編號，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。
(2) 在上述7支 試管 中，分別加入1%酪蛋白溶液1ml，于40℃ 水浴 中保溫15分鐘，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3ml，充分搖勻，各管分別用濾紙過濾。
(3)分別吸取濾液1ml放入另7支試管中，加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5ml，福林試劑1ml，充分搖勻，于40℃ 水浴 中保溫15分鐘，然后于每管中各加入3ml 蒸餾 水，充分搖勻。
(4) 用721型分光光度計，以0號管作對照，在680nm處測定光密度。
(5) 以光密度為縱坐標，酪氨酸含量（微克數）為橫坐標，繪制標準曲線。
2.樣品測定
(1)精確稱取干酶粉2克，加入10ml pH10緩沖溶液，在小燒杯中溶解，并用玻璃棒攪拌，靜止片刻后，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復攪拌溶解4次，最后全部移入200ml容量瓶中。
用緩沖溶液定容至刻度，充分搖勻，用二層紗布或四層紗布過濾，吸取濾液5ml，，移入100ml容量瓶中，用 蒸餾 水稀釋至刻度，所得液為稀釋2000倍的酶液。
(2)取3支干燥的試管，按下表編號，并嚴格按照表中順序加入試劑和操作。
| 試管編號 試劑 | 對照 | 1 | 2 |
| PH10緩沖溶液(ml) | 1 | 1 | 1 |
| 1:2000堿性蛋白酶(ml) | 1 | 1 | 1 |
| 0.4mol/L三氯醋酸溶液(ml) | 3 | 0 | 0 |
| 1%酪蛋白溶液(ml) | 1 | 1 | 1 |
| 40℃水浴保溫(分鐘) | 15 | 15 | 15 |
| 0.4mol/L三氯醋酸溶液（ml） | 0 | 3 | 3 |
搖勻后，各管分別過濾，吸取濾液1ml，加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5ml，福林試劑1ml，充分搖勻，于40℃水浴保溫15分鐘，然后每管各加入3ml蒸餾水，搖勻。用721型 分光光度計 在波長680nm處，以對照管為對照，測定兩管的光密度。
【實驗結果】
1.本實驗中堿性 蛋白酶 活力單位的定義：
1克堿性 蛋白酶 粉在pH10，40℃的條件下，每分鐘水解酪蛋白能產生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位。
2. 本實驗中堿性蛋白酶活力單位的計算：
每克堿性蛋白酶的活力單位 = m / t ×f
m： 樣品所測定的光密度值，經查標準曲線求得的酪氨酸量（μg）
t： 酶促反應的時間
f： 酶的稀釋倍數，本實驗中f = 2000
【思考題】
1. 什麼是酶活力？酶活力是怎樣計算的？
2. 酶活力測定過程中應注意哪些問題？
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