堿性蛋白酶活力測定
【實驗?zāi)康摹?/span>
1. 掌握測定堿性蛋白酶活力的原理和酶活力的計算方法。
2. 學(xué)習(xí)測定酶促反應(yīng)速度的方法和基本操作。
【實驗原理】
酶活力是指酶催化某些化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度。
酶促反應(yīng)的速度可以用單位時間內(nèi)反應(yīng)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。由于酶促反應(yīng)速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應(yīng)的初速度。
堿性蛋白酶在堿性條件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑 （磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）發(fā)生福林酚反應(yīng)。
（福林酚反應(yīng)：福林試劑 在堿性條件下極其不穩(wěn)定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現(xiàn)出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用堿性蛋白酶在單位時間內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生的酪氨酸的量來表示酶活力。
【實驗材料】
1.實驗器材
電熱恒溫水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度計
2.實驗試劑
(1)福林試劑：在1L容積的磨口回流瓶中加入50g鎢酸鈉(Na 2 WO 4 ·2H 2 O)、125g鉬酸鈉(Na 2 MoO 4 ·2H 2 O)、350ml蒸餾水、25ml 85％磷酸及50ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h。
回流完畢，再加25g硫酸鋰、25ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后定容到500ml。過濾，置于棕色瓶中暗處保存。使用前加4倍蒸餾水稀釋。
(2)1%酪蛋白溶液：稱取酪蛋白1克于研缽中，先用少量蒸餾水濕潤后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸餾水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分鐘，溶解后冷卻，定容至100ml，保存于冰箱內(nèi)。
(3)pH10緩沖溶液：
甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O) 19克，用蒸餾水溶解并定容至1000ml 。
乙液：0.2mol/L氫氧化鈉溶液
配制pH10硼砂氫氧化鈉溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml，用蒸餾水定容至200ml。
(4)標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液：精確稱取酪氨酸50mg，加入1ml 1mol/L鹽酸溶解后用蒸餾水定容至50ml，即得1mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
(5)0.4mol/L碳酸鈉溶液,0.4mol/L三氯醋酸溶液。
【實驗操作】
1.制備酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
(1) 取7支 試管 ，編號，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。
(2) 在上述7支 試管 中，分別加入1%酪蛋白溶液1ml，于40℃ 水浴 中保溫15分鐘，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3ml，充分搖勻，各管分別用濾紙過濾。
(3)分別吸取濾液1ml放入另7支試管中，加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5ml，福林試劑1ml，充分搖勻，于40℃ 水浴 中保溫15分鐘，然后于每管中各加入3ml 蒸餾 水，充分搖勻。
(4) 用721型分光光度計，以0號管作對照，在680nm處測定光密度。
(5) 以光密度為縱坐標(biāo)，酪氨酸含量（微克數(shù)）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.樣品測定
(1)精確稱取干酶粉2克，加入10ml pH10緩沖溶液，在小燒杯中溶解，并用玻璃棒攪拌，靜止片刻后，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復(fù)攪拌溶解4次，最后全部移入200ml容量瓶中。
用緩沖溶液定容至刻度，充分搖勻，用二層紗布或四層紗布過濾，吸取濾液5ml，，移入100ml容量瓶中，用 蒸餾 水稀釋至刻度，所得液為稀釋2000倍的酶液。
(2)取3支干燥的試管，按下表編號，并嚴格按照表中順序加入試劑和操作。
| 試管編號 試劑 | 對照 | 1 | 2 |
| PH10緩沖溶液(ml) | 1 | 1 | 1 |
| 1:2000堿性蛋白酶(ml) | 1 | 1 | 1 |
| 0.4mol/L三氯醋酸溶液(ml) | 3 | 0 | 0 |
| 1%酪蛋白溶液(ml) | 1 | 1 | 1 |
| 40℃水浴保溫(分鐘) | 15 | 15 | 15 |
| 0.4mol/L三氯醋酸溶液（ml） | 0 | 3 | 3 |
搖勻后，各管分別過濾，吸取濾液1ml，加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5ml，福林試劑1ml，充分搖勻，于40℃水浴保溫15分鐘，然后每管各加入3ml蒸餾水，搖勻。用721型 分光光度計 在波長680nm處，以對照管為對照，測定兩管的光密度。
【實驗結(jié)果】
1.本實驗中堿性 蛋白酶 活力單位的定義：
1克堿性 蛋白酶 粉在pH10，40℃的條件下，每分鐘水解酪蛋白能產(chǎn)生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位。
2. 本實驗中堿性蛋白酶活力單位的計算：
每克堿性蛋白酶的活力單位 = m / t ×f
m： 樣品所測定的光密度值，經(jīng)查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酪氨酸量（μg）
t： 酶促反應(yīng)的時間
f： 酶的稀釋倍數(shù)，本實驗中f = 2000
【思考題】
1. 什麼是酶活力？酶活力是怎樣計算的？
2. 酶活力測定過程中應(yīng)注意哪些問題？
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