紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度
[目的]:
掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理，熟悉紫外分光光度計(jì)的使用
[原理] :
蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)，但由于各種蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要準(zhǔn)確定量，必需要有待測(cè)蛋白質(zhì)的純品作為標(biāo)準(zhǔn)來比較，或且已經(jīng)知道其消光系數(shù)作為參考。另外，不少雜質(zhì)在280nm波長下也有—定吸收能力，可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴(yán)重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同時(shí)存在核酸時(shí)，必須同時(shí)測(cè)定OD 260 nm，與OD 280 nm。，然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值，通過經(jīng)驗(yàn)公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量。
本法操作簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量測(cè)定。主要缺點(diǎn)：當(dāng)待測(cè)的蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時(shí)，則產(chǎn)生—定誤差，混有核酸時(shí)必須分別測(cè)定280nm和260nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。
[操作]
取試管7支，按下表操作：
各管混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計(jì)，以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，分別于280nm、260nm波長下測(cè)定各管光密度
[計(jì)算]
(一) 直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液與待測(cè)液的光密度值(OD280nm)，或從標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣本蛋白質(zhì)含量。
以標(biāo)準(zhǔn)管各管光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測(cè)定管光密度值，直接查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣本中蛋白質(zhì)的含量。
1． 選一種與待測(cè)樣本蛋白質(zhì)氨基酸組成相近似的蛋白質(zhì)純品，用生理鹽水稀釋至濃度為 lmg／m1，作為稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。
2．用生理鹽水稀釋待測(cè)樣本蛋白質(zhì)至濃度約為lmg／m1，即為稀釋樣本蛋白質(zhì)溶液。
(二)利用經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算樣本蛋白質(zhì)含量，
準(zhǔn)確吸取血清樣本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，即500倍稀釋，在280nm和260nm兩處波長分別測(cè)得光密度值、再按下列公式計(jì)算。
1、OD 280 ／0D 260 ＜1.5時(shí)，用Lowry-Kalokar公式：
樣本蛋白質(zhì)含量(mg／m1)＝1.45OD 280 一0.74OD2 60
2、OD 280 ／OD 260 ﹥1.5時(shí)，用Lamber-Beer定律計(jì)算：
樣本蛋白質(zhì)含量(mg／m1) = OD 280 ／K×L＝（OD 280 ／6.3×1）×10g／L
本實(shí)驗(yàn)樣品：牛血清白蛋白E 1% cm＝6.3（100ml／cm.g）
K：克分子消光系數(shù)；E 1% cm：百分比吸光度的吸光系數(shù)；
注：不同蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量有差異，故標(biāo)準(zhǔn)管與測(cè)定管的蛋白質(zhì)氨基酸組成應(yīng)相似，以減小誤差。
[器材]
(一)UV-9200紫外分光光度計(jì)
(二)50ml容量瓶
[試劑]
(一) 生理鹽水
(二) 清蛋白(人或牛)純晶
(三) 待測(cè)樣本蛋白質(zhì)：用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的樣品用生理鹽水稀釋而成。
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