基于不同光學平臺的熒光共振能量轉移(FRET) 技術
[摘 要]: 熒光共振能量轉移( FRET)是用于對生物大分子之間相互作用定性、定量檢測的一種有效方法。根據所基于的熒光顯微鏡配置不同而有不同的應用側重，可在溶液，細胞懸液，多細胞，單細胞，細胞膜，細胞器等不同層次對生物大分子間的相互作用距離，動力學特性等進行研究。本文就基于常規寬場熒光顯微鏡、全內反射熒光顯微鏡，連續激光共聚焦顯微鏡、脈沖多光子激發顯微鏡等顯微技術的FRET方法分別進行了介紹和對比評估。對于實驗室應用和配置FRET系統具有參考意義.
[關鍵詞]: 熒光共振能量轉移,W-FRET，TIRF-FRET, Confocal- FRET，MP-FRET
1介紹
隨著生命科學研究的不斷深入, 光學顯微鏡使我們理解了細胞結構和有關功能。但是分子生物學研究已經顯示了分子事件，例如信號傳導和基因翻譯，需要蛋白質的裝配成特殊的大分子復合體等。對各種生命現象發生的機制,特別是對細胞內蛋白質間相互作用的研究變得尤為重要。傳統的生物物理或生物化學方法例如親和色譜法或免疫沉淀反應法和近來的酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標記等方法等，都需要破碎細胞或對細胞造成損傷，無法做到在活細胞生理條件下實時地對細胞內蛋白質-蛋白質間相互作用進行動態研究。
而基于強度的影像技術例如FRET方法(寬場，共聚焦，雙光子)，使得研究活細胞內的這些相互作用變得容易了(Periasamy, 2001)。新的影像技術，結合開發新的基因編碼的熒光基團標記和傳感器以及計算機影像采集和分析軟件的能力增強，使許多復雜的研究例如蛋白質功能和加工、基因表達和第二信使傳遞、胞內信號傳導等研究成為可能。(Roessel and Brand, 2002).
FRET是通過分子間的電偶極相互作用將供體激發態能量轉移到受體激發態的過程,它是一種非輻射躍遷[2 ]，發生FRET時，分子間距離小于10nm。如果發生FRET，則供體通路信號將淬滅而受體通路信號將激活或增強(Herman, 1998)。FRET顯微技術高度依賴如何快速高效地捕獲來自標定分子間相互作用的短暫微弱的熒光信號的能力。由于能量傳遞發生在1-10nm，一個FRET信號代表了一個顯微鏡圖象中的一個特殊位置。這等效于提供了一個額外的放大倍數，使 FRET超越顯微鏡的分辨率限制而以分子尺度分辨出供體-受體的平均距離，并能顯示出受體-供體的相互作用。
2基于不同光學平臺的FRET顯微技術
FRET供體受體配對
廣泛用于FRET研究的的供體-受體熒光基團來自自發熒光蛋白GFPs.。選擇GFPs作為可工作的FRET對，要仔細考慮其光譜特性：對選定的供體受體配對，它們的激發光譜要足夠分離，供體發射光譜與受體激發光譜部分重疊(>30%)以獲得足夠的能量傳遞；供體受體發射光譜的合理分隔，以便獨立測量每個熒光基團的熒光。
根據生物學應用的不同，有一些FRET對的組合。常用的FRET對熒光基團有：CFP-YFP；CFP-dsRED；BFP-GFP；GFP-dsRED；YFP-dsRED；Cy3-Cy5；Alexa488-Alexa555；Alexa488-Cy3；FITC- Rhodamine (TRITC)；YFP-TRITC ；YFP- Cy3。
FRET方法配置
FRET方法可以基于不同的光學平臺配置，適用面很寬。一般的FRET系統都包含如下配置：
激發光源：穩定的汞燈、氙燈、汞氙復合電弧燈光源；從紫外到紅外波段不同波長的激光光源。
中性密度濾光片：用以控制激發光的強度。
濾鏡組：為選定的熒光基團組合配置合適的濾鏡組，包括激發，發射，二色分光等。需要仔細選擇濾鏡組合，以削減光譜串色，提高FRET信號的信號噪聲比。
檢測設備：高靈敏度PMT或冷CCD。
根據所使用的光學平臺配置，可將FRET顯微技術分為如下兩類：單光子激發和多光子激發。單光子激發類中包括基于常規寬場的(Wide-Field)W-FRET，全內反射TIRF-FRET)，共聚焦(confocal)C-FRET。多光子激發中包括雙光子和多光子(MP-FRET)。
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