雙重PCR
【摘要】 目的建立抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的快速檢測方法。方法：針對轉(zhuǎn)基因大豆基因組中被導入的35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因，自行設計了兩對引物，采用雙重PCR同時擴增上述基因，用8g/L羥丙基甲基纖維素為篩分介質(zhì)，在50cm×100μm i．d．涂壁毛細管中，于一10kV電壓下用激光誘導熒光-毛細管電泳檢測轉(zhuǎn)基因大豆的PCR擴增產(chǎn)物。結(jié)果在優(yōu)化的PCR反應和毛細管電泳條件下，本法可以同時檢測出轉(zhuǎn)基因大豆樣品中三種外源基因，雙重PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序證實與原基因序列完全一致，表明本研究設計的引物合理，擴增結(jié)果可靠。毛細管電泳進樣量僅需5nl，分析時間為24min，遷移時間的相對標準偏差≤3.2。結(jié)論本方法較常規(guī)瓊脂 糖凝膠電泳特異性高，分析時間短，重現(xiàn)性好，檢測靈敏，適合于大豆中轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測。
【關鍵詞】雙重PCR ；激光誘導熒光-毛細管電泳；轉(zhuǎn)基因大豆PCR產(chǎn)物檢測；羥丙基甲基纖維素
隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的大量種植，其安全性問題也日益受到人們的重視。2002年我國要求對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物實行標簽管理。抗草甘膦(glyphosate)大豆(商品名，roundup ready soybean)是在傳統(tǒng)大豆株Variety A5403中轉(zhuǎn)入外源基因CAMV-35S啟動子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS終止子而得到。它是目前使用最廣的轉(zhuǎn)基因作物之一，每年至少有800萬噸轉(zhuǎn)基因大豆進入我國市場。因此，研究抗草甘膦大豆的快速檢測方法具有重要意義。目前采用PCR檢測轉(zhuǎn)基因大豆的方法大多是采用瓊脂糖凝膠電泳 法，首先檢測CAMV-35S啟動子和NOS終止子進行篩選，然后檢測EPSPS抗草甘膦基因，操作煩瑣、費時。本研究利用雙重PCR技術同時擴增上述基因片段，用激光誘導熒光-毛細管電泳高效、快速檢測PCR產(chǎn)物，顯著提高了檢測效率，并使靈敏度大為增加。本方法所需樣品量少(nl級)，快速、靈敏和準確，已成功用于實際轉(zhuǎn)基因大豆樣品的分析。
1 材料和方法
1．1 儀器與試劑
毛細管電泳-激光誘導熒光檢測裝置(自行組裝)，其中氦氖激光器(543.5nm，JDS Uniphase，USA)參數(shù)控制和數(shù)據(jù)采集用本實驗室編制的windows軟件控制。石英毛細管(河北永年光導纖維廠)：長50cm和40cm，有效長度為43 cm和32cm，內(nèi)徑分別為50μm、75μm 和100μm，外徑為375μm。毛細管柱內(nèi)表面的聚丙烯酰胺化學鍵合涂層由本實驗室完成。UNO 型PCR儀(德國Biometre公司)，PAC3000型電泳儀(美國BIO RAD公司)，UVI紫外成像分析儀(英國UVI公司)。
陽性抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆標準物質(zhì)(IRMM-410R，F(xiàn)luka公司)、進口轉(zhuǎn)基因大豆樣品和非轉(zhuǎn)基因大豆由國家進出口商品檢驗研究所提供；溴乙錠，羥丙基甲基纖維素(hydroxy-propylmethacrylate，HPMC-4000)，Sulforhdamine B(美國Sigma公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海化學試劑總廠)，乙二胺四乙酸，硼酸(分析純，成都化學試劑公司)；Taq DNA 聚合酶，dNTPs，pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker(晶美生物工程有限公司)。所用水均為無菌重蒸水。
1．2 寡核苷酸引物
在充分了解抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆引入的外源基因的基礎上，利用Primer premier5．0軟件自行設計了兩對引物。引物ZY1-35S和ZY2-EPSPS擴增35S和cp4-EPSPS之間的片段，引物ZY3-NOS和ZY4-NOS擴增NOS終止子序列。內(nèi)源基因Lectin基因引物按文獻設計。上述3對引物的序列信息由上海博亞生物技術有限公司合成。
1．3 實驗方法
1．3．1 總DNA提取 參照文獻，用CTAB法提取植物總DNA。
1．3．2 PCR體系及反應條件 雙重PCR反應體系：1×buffer，2.5mmol/L MgC12，0.25mmol/L dNTP，primers(0.4 μmol/L ZY1-35S，ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS，ZY4-NOS)，1.5units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA100～200ng，總反應體積25μ1。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性3min；95℃ 45s，55℃ 60s，72℃ 45s，共35個循環(huán)；72℃延伸5min。
內(nèi)源基因(Lectin)的PCR 反應體系：1×buffer，2.0mmol/L MgC12，0.2mmol/L dNTP，0.2μmol/L primers。1.0 units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA1O0～200ng，總反應體積25μ1。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性3min；95℃ 45s，58℃ 60s，72℃ 45s，共35個循環(huán)；72℃延伸5min。
1．3．3 PCR產(chǎn)物的高效毛細管電泳 在電泳分析前，先將毛細管柱填充1g/L HPMC，再充以含有3.75μmol/L溴乙錠的8g/L HPMC，電泳分離的緩沖溶液為TBE溶液(45mmol/L Tris，45mmol/L boric acid，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)。取PCR擴增產(chǎn)物1Oμl加入內(nèi)標2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl，在-1OkV下電動進樣20 s，并在-1OkV下恒壓電泳，用543.5nm 波長的激光激發(fā)DNA片段與溴乙錠的結(jié)合物產(chǎn)生熒光，在590nm波長下檢測。電泳溫度為20℃。每次電泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液沖洗毛細管5min，再進行下一次檢測。pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker用作DNA marker，使用時Maker用適量無菌水稀釋。電泳圖譜和實驗數(shù)據(jù)用C++語言編制的windows軟件進行采集和分析處理。
1．3．4 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 將5μl PCR產(chǎn)物與1μl上樣buffer混合后上樣于30g/L瓊脂糖凝膠中(含0.1μg/ml溴化乙錠)。在0.5×TBE電泳緩沖液中，于100V電壓下，電泳50min，采用pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)DNA Marker同時電泳，然后用UVI紫外成像分析儀觀察結(jié)果。
2 結(jié)果與討論
2．1 毛細管電泳條件的優(yōu)化
2．1．1 毛細管柱長和內(nèi)徑的選擇 分別采用不同內(nèi)徑和長度的涂層石英毛細管柱：50cm×50μmi．d．；50 cm × 75μmi．d．；50cm×100μm1．d．；40cmx 100μm i．d．進行試驗。實驗結(jié)果表明，內(nèi)徑為100μm的毛細管對DNA 片段標準物質(zhì)pUC19DNA/Msp I(Hpa Ⅱ)Marker 中的110(111)/147 bp DNA 片段的分離度可達2.91，而且內(nèi)徑為100μm的毛細管柱檢測光程較大，因而較內(nèi)徑為50μm和75μm的毛細管柱的檢測靈敏度高。采用內(nèi)徑為100μm的毛細管柱，減少其長度至40cm，對110(111)/147bp標準DNA片段的分離度減少至2.13。因此本實驗選用50cm×100μm i．d．的毛細管進行電泳分離。
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