姐妹染色單體分化染色
1. 實驗原理
姐妹染色單體分化染色法(Sister chromatid differentiation，SCD)是20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的染色體處理技術(shù)。1973年Latt在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromode Oxyurdine，BrdU），用Hoechst 33258 熒光染料染色時，發(fā)現(xiàn)了姐妹染色單體的色差反應(yīng)和它們之間互換的現(xiàn)象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改進了這一技術(shù)，用Giemsa染色。SCD形成原理（圖13-2）是：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入5-溴脫氧尿苷，當(dāng)細(xì)胞的DNA復(fù)制時，Brdu可作為核苷酸前體物專一取代胸腺嘧啶而被摻入到新合成DNA鏈中。第二周期加入BrdU，每條新合成的染色單體DNA雙鏈中舊模板沒有摻入，半保留復(fù)制的新鏈被BUdR摻入；當(dāng)細(xì)胞處于第三個分裂周期時，同一染色體的兩條姐妹染色單體，一條由雙股都含有BrdU的DNA鏈構(gòu)成，而另一條為單股含有BrdU的DNA鏈。在結(jié)構(gòu)上雙股含BrdU的DNA螺旋化程度降低，故對染色劑親和力低，在用Giemsa染色時著色淺，只有單股含BrdU的DNA鏈組成的單體則著色深而形成差別著色。應(yīng)用姐妹染色單體區(qū)分染色法研究來自一個染色體的兩條單體之間在同一個位點發(fā)生同源片段的交換，稱為姐妹染色單體互換（sister chromotid exchange,SCE）。SCE是兩條染色單體核苷酸序列發(fā)生互換而表現(xiàn)出來的一種現(xiàn)象。
這種技術(shù)用于研究細(xì)胞周期、染色體半保留復(fù)制、染色體的分子結(jié)構(gòu)和畸變，以及DNA的復(fù)制、損傷與修復(fù)等一系列重要理論問題。由于SCE能靈敏地檢測染色體的變化，表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，還可以將姐妹染色單體互換頻率列為檢測致突變物、致癌物的常規(guī)指標(biāo)之一。
2. 實驗對象 所檢培養(yǎng)細(xì)胞。
3. 實驗試劑與器材
（1）BrdU貯存液的配制：BrdU 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）然后加蒸餾水至 5ml即成1000μg/ml的貯存液，因BrdU遇光會發(fā)生分解，貯存液需置棕色瓶并黑紙封瓶避光冰凍保存；
（2）2×SSC液，水浴鍋，20W紫外燈一個，培養(yǎng)皿，鏡頭紙。
4. 實驗方法與步驟
（1）Brdu摻入：細(xì)胞培養(yǎng)24h后于培養(yǎng)液中加入Brdu，最終濃度10μg/ml，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
（2）待細(xì)胞經(jīng)歷兩個細(xì)胞周期（48h），培養(yǎng)終止前4h加秋水仙素，秋水仙素終濃度為0.02μg/ml培養(yǎng)液；
（3）常規(guī)制片，染色體制片在 37℃ 恒溫箱內(nèi)老化24h；
（4）紫外燈照射：取標(biāo)本玻片置于大號培養(yǎng)皿內(nèi)，正面朝上，上覆蓋鏡頭紙，從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸濕，移入 60℃ 水浴鍋內(nèi)，紫外線燈距離 5cm ，照射30min；
（5）染色：取出照射后標(biāo)本，蒸餾水沖洗，置pH6.8的2%Giemsa染色10min。
5. 注意事項
（1）BrdU是一種強突變劑，使用濃度不宜過高，否則會產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。
（2）影響SCE的因素：地區(qū)與環(huán)境，Brdu的濃度，動物的種類，染色體長度，培養(yǎng)時間與溫度。
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