葡聚糖凝膠過濾法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量方法
實(shí)驗(yàn)原理
葡聚糖凝膠(Sephadex)過濾法測(cè)定蛋白質(zhì)分子 量的原理，主要是依據(jù)這種凝膠具有分子篩作用，一定型號(hào)的凝膠具有大體上一定大小的孔徑。在一定的凝膠柱內(nèi)，凝膠孔隙所占的體積稱為內(nèi)水容積Vi，凝膠顆粒間的自由空間所占的體積稱為外水容積V0。當(dāng)樣品流經(jīng)凝膠柱時(shí)，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內(nèi)部，只需V0體積的洗脫液便可將其由一端洗脫到另一端；相反，如果樣品體積小于孔隙，則需要V0+Vi體積的洗脫液，才能將它們由一端洗脫到另一端。中等分子(分子大小在上述兩種極限之間)所需洗脫液體積介于兩者之間，Ve=V0+KdVi(0<1)，如圖4.1所示。< p=""> <1)，如圖4.1所示。<>
Kd為分配系數(shù)，它表示一種物質(zhì)在孔隙內(nèi)的滲透程度，相當(dāng)于這種物質(zhì)在孔隙內(nèi)所占體積和孔隙總體積的比值。
如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時(shí)沒有顯著的水合作用，則不同大小分子 量的蛋白質(zhì)，進(jìn)入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定于分子大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在10000～15000時(shí)，蛋白質(zhì)在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系。若用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在一定型號(hào)葡聚糖凝膠柱上層析，精確測(cè)其洗脫體積，并以洗脫體積Ve對(duì)分子量的對(duì)數(shù)logMW作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4.2)。未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下層析，根據(jù)其洗脫體積即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。
圖 4.2三個(gè)不同大小分子 組份上柱洗脫曲線示意圖
本方法測(cè)分子 量設(shè)備簡(jiǎn)單，結(jié)果處理方便，因此應(yīng)用較廣泛。但本方法僅適用于軸比相近似為球狀蛋白，對(duì)軸比大的纖維蛋白不適用；對(duì)含量大于5%的糖蛋白因有較大水合作用，測(cè)得分子量偏高；對(duì)含鐵蛋白測(cè)定數(shù)據(jù)偏低。
圖4.3Ve 對(duì)log MW作圖
由于Ve與柱的大小有關(guān)，如果用Ve/V0對(duì)logMW作圖，同樣可得一線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且可消除柱的大小和吸附效應(yīng)的誤差(見圖4.3)。
1. 細(xì)胞色素c 2. 核糖核酸酶 3. 肌紅蛋白 4. α-胰凝乳蛋白酶 5. 胰蛋白酶 6. 胃蛋白酶 7. 過氧化物酶 8. 卵清蛋白 9. 血清白蛋白 10. 鐵蛋白
圖4.4 Ve / V0對(duì)log MW作圖
試劑和器材
一、試劑洗脫液：0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，0.1M KCl溶液：稱取12.12g Tris，15g KCl，先用少量去離子水溶解，再加入6.67mL濃HCl，用去離子水定容至2L。
藍(lán)色葡聚糖2000；Sephsdex G-100；N-乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液(以洗脫液飽和)。
二、材料
牛血清白蛋白(Mr 67 000)；卵清蛋白(Mr 43 000)；胰凝乳蛋白酶原(Mr 25 000)；細(xì)胞色素c(Mr 12 800)。
三、儀器層析柱；恒壓洗脫瓶； 紫外檢測(cè)儀或紫外分光光度計(jì)；自動(dòng)分部收集器。
操作方法
一、溶脹凝膠
取Sephadex G-100 15g，加200mL蒸餾水，沸水浴中溶脹5小時(shí)。待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細(xì)顆粒，然后再放些蒸餾水?dāng)噥y，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無細(xì)顆粒為止。溶脹平衡和漂洗凈的凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。
二、裝柱
層析柱必須粗細(xì)均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般柱直徑(內(nèi)徑)為1cm, 如果樣品量比較多，最好用直徑2 ~ 3cm的柱。通常柱愈長(zhǎng)，分離效果愈好，但柱過長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)而且樣品稀釋度大，易擴(kuò)散，反而分離效果不好。當(dāng)用作脫鹽時(shí)，柱高度為50cm比較合適；在進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)，100cm高度就夠了。
裝柱時(shí)，將柱垂直至于鐵架上。在柱中加約1/3柱容積的洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，使支持濾板底部完全充滿液體，然后將柱的出口關(guān)閉。把已經(jīng)溶脹好的凝膠調(diào)成薄漿，傾入柱內(nèi)，膠粒逐漸擴(kuò)散下沉。當(dāng)沉積的膠床至2～3cm高時(shí)，打開柱的出口，并注意控制操作壓以均勻不變的流速直到膠裝完為止。柱裝好后，在床的上面蓋上一張大小略小與柱內(nèi)徑的濾紙片，以防止樣品中一些不溶物質(zhì)混入床中和加樣時(shí)凝膠被沖起。再以洗脫液平衡柱層，直至層析的膠床高不變?yōu)橹?。柱裝得是否均勻，可用藍(lán)色葡聚糖上柱檢驗(yàn)；如果色帶均勻下移，說明柱子已裝好，可以使用。
三、上樣
稱取0.5mg藍(lán)色葡聚糖2000(分子量200萬以上)四份，分別放在稱量瓶中，再稱取標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白(Mr 67 000)；卵清蛋白(Mr 43 000)；胰凝乳蛋白酶原(Mr 25 000)；細(xì)胞色素c(Mr 12 800)各10mg，分別放在各稱量瓶中；各瓶加入N-乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液0.5mL，使混合物溶解后分別上柱。
樣品上柱是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，影響層析效果。上樣時(shí)應(yīng)盡量保持床面的穩(wěn)定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1～2mm時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將樣品慢慢地加至柱床表面，打開出口并開始計(jì)算流出體積，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口，同加樣品時(shí)一樣小心地加入少量洗脫液，再打開柱的出口，使床表面的樣品也全部滲入柱內(nèi)。這時(shí)樣品已加好，在床的表面再小心地加洗脫液，使高出床表面3～5cm。
四、收集和鑒定
層析開始，在柱的出口處以試管分管收集流出液，流速為0.4mL/min, 4mL/管，收集液在280nm處測(cè)OD值。最高的一個(gè)OD值時(shí)的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。當(dāng)N-乙酰酪氨酸乙酯洗脫峰出現(xiàn)后(此峰洗脫體積不必記錄)；按同樣的方法進(jìn)行第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的上柱，操作方法和步驟同前。
將各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)得的洗脫體積Ve對(duì)它們的分子量對(duì)數(shù)作圖，則應(yīng)獲得一線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
注意事項(xiàng)
(1)根據(jù)層析柱的容積和所選用的凝膠溶脹后住床容積，計(jì)算所需凝膠干粉的重量，以將用作洗脫劑的溶液使其充分溶脹。
(2)層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般來說，細(xì)長(zhǎng)的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時(shí)分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時(shí)，會(huì)發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱管中心部分的組份移動(dòng)慢，而管壁周圍的移動(dòng)快。柱越長(zhǎng)，分離效果越好，但柱過長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。
對(duì)于脫鹽的柱一般都是短而粗，柱長(zhǎng)(L)/直徑(D)<10；對(duì)分級(jí)分離用的柱，L/D值可以比較大，對(duì)很難分離的組份可以達(dá)到L/D=100，一般選用內(nèi)徑為1cm，柱長(zhǎng)100cm就夠了。
(3)裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過程中，凝膠床高度下降。
(4)始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。
(5)用此方法測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，受蛋白質(zhì)形狀的影響，并且測(cè)得的結(jié)果可能是聚合體的相對(duì)分子量，因而還需用電泳等方法進(jìn)一步驗(yàn)證相對(duì)分子量測(cè)定結(jié)果。
北京天優(yōu)福康生物科技有限公司
官網(wǎng)：http://www.jyzjsd.com/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
