磷鉬酸比色法測定血糖
一、實驗目的
1.掌握磷鉬酸比色法測定血糖的原理及方法。
2.學會制備無蛋白血濾液。
二、實驗原理
葡萄糖的醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱后，被氧化成羧基，而堿性銅試劑中的二價銅(Cu 2+ )則被還原成紅色的氧化亞銅(Cu 2 O)沉淀，氧化亞銅又可使磷鉬酸還原，生成鉬藍，使溶液呈藍色，其藍色的深度與血濾液中葡萄糖的濃度成正比，可用比色法于620nm 下測定之。
測定血糖含量時必須先除去其中的蛋白質，制成無蛋白濾液，再行檢驗。向抗凝血(如加入草酸鉀的血液)中加入鎢酸鈉、硫酸鋅、氫氧化鋅及三氯乙酸等均可制得無蛋白濾液，現常用鎢酸法。鎢酸鈉與硫酸作用，生成鎢酸，可使血紅蛋白等凝固、沉淀、離心或過濾除去沉淀，即得無蛋白濾液，此種濾液還 適用于測定非蛋白氮、肌酸和尿酸等。
Na 2 WO 4 +H 2 SO 4 → H 2 WO 4 +Na 2 SO 4
鎢酸鈉 鎢酸
三、 儀器 、實驗材料和試劑
儀器
奧氏吸量管(1mL)、小漏斗、吸量管(1mL、10mL)、錐形瓶(25mL)、血糖管、分光光度計、試管和試管架、恒溫水浴箱(100℃ C)、煤氣燈或電爐。
實驗材料
抗凝血
試劑
1. 草酸鉀粉末(A.R)
2. l0％鎢酸鈉溶液：此溶液應為中性或弱堿性．否則蛋白沉淀不完全，其校正方法是取此溶液10mL，加入0.05mol/L，硫酸溶液0.4mL，再加人1％酚酞指示劑1滴，溶液應呈粉紅色，若呈紫紅色，可加人0.05mol/L 硫酸溶液，若呈黃色，需加入0.1mol/L 氫氧化鈉溶液，直到出現不褪色的粉紅色的中性反應為止，計算出應加的酸或堿的量。
3. 3mol/L 硫酸溶液
4. 葡萄糖標準液
儲存液：稱取1000mg 恒重過的葡萄糖(A .R)，溶于水，稀釋到100mL，其質量濃度為10g/L。
應用液：取1mL 儲存液置于100mL 容量瓶中，用苯甲酸稀釋到刻度，質量濃度為0.1g/L。
5. 堿性銅 試劑 在400mL 蒸餾水中加人40g 無水碳酸鈉；在300mL 蒸餾水中加入7.5g 酒石酸，在200mL 蒸餾水中加入4.5g 硫酸銅結晶，分別加熱使溶解，冷卻后將灑石酸溶液傾入碳酸鈉溶液中．混合液移入1000mL 容量瓶中，再將硫酸銅溶液傾入并加蒸餾水至刻度。此試劑可于室溫下長期保存。
如有沉淀產生，需過濾后方可使用。
6. 磷鉬酸試劑在燒杯內加入鉬酸70g、鎢酸10g、10％氫氯化鈉溶液400mL 及蒸餾水400mL，混合后置于100℃恒溫 水浴 箱中保溫20～40min，驅去鉬酸中可能存在的溴，如圖3－1。冷卻后加入250mL濃磷酸(85％)，混勻，稀釋至1000mL。
7. 0.25％苯甲酸溶液
四、操作步驟
(一)鎢酸法制備1:10全血封鎖蛋白濾液
用奧氏吸量管①吸取1mL，混勻的抗凝血(每L 血液含2g 草酸鉀)，擦去管外血液。將管插到25mL錐形瓶的瓶底，緩緩放入②錐形瓶內。
加入7mL 蒸餾 水，充分混勻，使完全溶血后，再加入1/3mol/L 硫酸溶液1mL，隨加隨搖，再加入1mL10％鎢酸鈉溶液，隨加隨搖。加完后充分搖勻，放置5～10min．待沉淀由鮮紅色變為暗棕色③，即用優質不含氮的干濾紙過濾，在漏斗上蓋一表面皿，以減少Cu 與空氣的接觸，如此制得的無蛋白濾液每mL 相當干1/10mL 全血。
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