目的基因序列的來(lái)源和分離
第四節(jié) 目的基因序列的來(lái)源和分離
一、 基因組 DNA文庫(kù)
從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA，用物理方法（超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）將DNA降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)?載體 （常用噬菌體、粘粒或YAC 載體 ）連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與 載體 連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫(kù)（genomic DNA library）。如果這個(gè)文庫(kù)足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫(kù)，能從這文庫(kù)中釣取該生物的全部基因或DNA序列。從基因組含有生物生存、活動(dòng)和繁殖的全部遺傳信息的概念出發(fā)，基因組文庫(kù)是具有生物種屬特異性的。
構(gòu)建基因組文庫(kù)，再用分子雜交等技術(shù)去釣取基因克隆的方法，稱為鳥槍法或散彈射擊法，意味著從含有眾多的基因序列克隆群中去獲取目的基因或序列。當(dāng)生物基因組比較小時(shí)，此法較易成功；當(dāng)生物基因組很大時(shí)，構(gòu)建其完整的基因組文庫(kù)就非易事，從龐大的文庫(kù)中去克隆目的基因工程量也很大。
二、cDNA文庫(kù)
以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補(bǔ)，稱為互補(bǔ)DNA或cDNA。提取出組織細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，基因組含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同分化時(shí)期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類和強(qiáng)度也不盡相同，所以cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫(kù)顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從基因組DNA文庫(kù)獲得的基因與從cDNA文庫(kù)獲得的不同，基因組DNA文庫(kù)所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫(kù)中獲得的是已經(jīng)過(guò)剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。
三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）
如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，polymerase chain reaction，從基因組DNA或cDNA中獲得目的基因，可不必要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的DNA文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程。PCR是70年代中期創(chuàng)立的技術(shù)，其基本原理如圖20-10所示。
PCR反應(yīng)系統(tǒng)包括含有目的基因或序列的DNA模板，對(duì)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，一對(duì)脫氧寡核苷酸引物、DNA合成所需要的4種脫氧核苷三磷酸以及保證聚合酶催化反應(yīng)的Mg2+及緩沖液等。人工合成引物的序列設(shè)計(jì)是PCR成功的關(guān)鍵，一般兩條引物的序列反應(yīng)分別與欲獲得的雙鏈DNA兩條鏈3’端的序列互補(bǔ)。先升高溫度使模板DNA變性、雙鏈分開；再降低溫度退火使引物與模板DNA配對(duì)互補(bǔ)結(jié)合；然后升溫到聚合酶反應(yīng)適宜的溫度，此時(shí)在聚合酶催化下，從引物3’羥基端開始，與模板DNA上的堿基配對(duì)逐個(gè)加上核苷酸，合成新的DNA鏈。其后再按高溫變性、低溫退火、適溫合成三步反復(fù)循環(huán)，新合成的DNA在下一循環(huán)中又作為模板使用，每循環(huán)一次，合成的目的序列擴(kuò)增一倍，而且很快擴(kuò)增的序列主要限制在所設(shè)計(jì)的一對(duì)引物規(guī)定的模板序列范圍內(nèi)，一般循環(huán)30-40次，按理論計(jì)算，目的序列可擴(kuò)增230-240倍，而實(shí)際上由于底物和引物的消耗，酶的失活等因素，產(chǎn)物量并不是始終以指數(shù)增加的，但通常實(shí)驗(yàn)獲得目的序列106-108倍的擴(kuò)增產(chǎn)物并不困難，因而PCR具有很高度的靈敏度，由于引物與模板的配對(duì)互補(bǔ)結(jié)合的特異的，因而PCR也具有高度的特異性。所以可以方便地用PCR在成千上萬(wàn)的基因序列中獲得只有極微含量的特定目的基因或序列，PCR獲得的目的序列產(chǎn)物連接在適當(dāng)?shù)妮d體上，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，經(jīng)篩選就能得到目的序列的克隆。
現(xiàn)在PCR技術(shù)還在不斷發(fā)展，已知部分序列或未知序列的基因有的也能設(shè)計(jì)PCR來(lái)擴(kuò)增和克隆，模板核酸可用雙鏈DNA，單鏈DNA，甚至RNA。由于PCR的高靈敏度和特異性，在基因診斷上有更廣泛的應(yīng)用，后面的章節(jié)還要敘述。
四、人工化學(xué)合成
隨化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)核酸合成儀已被廣泛應(yīng)用，按人們?cè)O(shè)計(jì)好的序列一次合成100-200bp長(zhǎng)的DNA片段已不成問(wèn)題。可能用這些合成的片段組合連接成完整的基因。但目前人工合成基因最大的限制是人們并未掌握怎樣的核酸序列能具有生命功能的規(guī)律，例如1kb長(zhǎng)的DNA最通常編碼功能蛋白質(zhì)的基因長(zhǎng)度就可以有～10600種不同的序列，隨意合成的DNA絕大多數(shù)肯定是不具有生物功能或無(wú)法知道它會(huì)有什么功能的，因而只能模仿自然界生物中已知的基因序列來(lái)合成，而化學(xué)合成這樣長(zhǎng)的基因DNA序列，其價(jià)格遠(yuǎn)高于用PCR法獲得基因，所以目前很少全部用化學(xué)方法去合成基因。但人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成核酸片段作為引物、接頭等已經(jīng)是分子生物學(xué)和基因工程中必不可少的、十分重要的手段。
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