人超敏C反應蛋白(HS-CRP)ELISA試劑盒的應用
一、背景
人超敏C反應蛋白(HS-CRP)ELISA試劑盒用于測定人血清，血漿及相關液體樣本中高敏C反應蛋白（hs-CRP）的含量。
實驗原理：試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人超敏C反應蛋白(hs-CRP)水平。用純化的抗超敏C反應蛋白(hs-CRP)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入人超敏C反應蛋白(hs-CRP),再與HRP標記的超敏C反應蛋白(hs-CRP)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的超敏C反應蛋白(hs-CRP)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中人超敏C反應蛋白(hs-CRP)濃度。
二、操作步驟
1、實驗準備：從冰箱取出試劑盒，恢復至室溫。濃縮洗滌液用超純水或蒸餾水稀釋20倍，待用。
2、加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加洗滌液100μl（不加DON抗體）.余孔分別加標準品或待測樣品50μl，然后再加入DON抗體50μl。注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
3、棄去孔內液體，甩干，用洗滌液洗板4次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4、每孔加酶標二抗100μl，37℃，30分鐘。
5、溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板4次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
6、依序每孔加顯色液100μl，37℃避光顯色（10分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
7、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8、用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
三、應用
用于老年維持性血液透析（MHD）患者穿透素3（PTX3）與超敏C反應蛋白（hs-CRP）及營養不良的關系的研究：
通過檢測老年MHD患者PTX3活性,進一步探討老年MHD患者PTX3與微炎癥及營養不良的關系,從而為防治老年MHD患者的營養不良和微炎癥提供新的方法。
方法：
1、研究對象:共納入經MHD治療3個月以上,尿素清除指數（effective urea clearnance time/volume,Kt/V）>1.2的患者共81例,根據年齡分為2組,其中老年組（年齡≥60歲）MHD患者61例,非老年組（年齡<60歲）MHD患者20例。原發病:慢性腎炎31例,高血壓腎病24例,糖尿病腎病16例,缺血性腎病1例,多囊腎1例,病因不明8例。同期于健康志愿者18例測取PTX3的醫學參考值范圍。
2、收集入選者一般資料:包括年齡、性別、透析齡、原發病、近期是否有感染。
3、監測項目及參數測定:測量血肌酐（serum creatinine,Scr）、血清白蛋白（albumin,Alb）、血紅蛋白（hemoglobin,HB）等指標,采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定PTX3,采用免疫透射比濁法測定hs-CRP,≥3mg/L為存在微炎癥狀態。采用單室模型Kt/V值做為評價所有入選的MHD患者透析充分性的指標。主觀綜合營養評估（subjective global assessment,SGA）根據包括體重、飲食等多個方面測量:分為良好（SGA1）、輕中度營養不良（SGA2）、重度營養不良（SGA3）。
4、統計學方法:應用相關統計軟件,計數資料應用x2檢驗。計量資料以均數±標準差表示,成組比較應用t檢驗。相關分析應用Pearson或Spearman直線相關及偏相關,P<0.05為差異有統計學意義。
結果：
1、一般情況比較:共納入81例患者,其中男性41例,女性40例,平均年齡為65.80±15.21歲（23-91歲）。其中MHD老年組男性（30人,49.18%）與MHD非老年組男性（11人,55.0%）所占比例、老年組Kt/V（1.39±0.14）與非老年組Kt/V（1.35±0.11）、老年組HB（107.02±16.65 g/L）與非老年組（107.85±14.39 g/L）、老年組透析齡（45.85±29.05月）與非老年組（51.35±27.37月）統計學上無明顯差異,P>0.05。
2、炎癥相關數據比較:老年MHD組的PTX3（3.09±1.19 OD450）及hs-CRP（5.52±3.09 mg/L）明顯高于非老年組的PTX3（2.24±0.90OD450）及hs-CRP（4.01±2.19 mg/L）,P<0.05。
3、營養相關數據比較:老年組營養不良42例（68.85%）,顯著高于非老年組營養不良9例（45.0%）,P<0.05。老年組Scr（707.31±267.82 mmol/L）、Alb（37.27±4.53 g/L）明顯低于非老年組Scr（997.80±137.88 mmol/L）、Alb（41.92±2.77 g/L）,P<0.05。
4、相關性比較:老年組PTX3與hs-CRP呈正相關（r=0.524,P<0.05）,與SGA呈正相關（r=0.417,P<0.05）,與Alb呈負相關（r=-0.479,P<0.05）,與scr無明顯相關性（r=-0.134,p>0.05）。控制性別年齡BMI值行偏相關:老年組PTX3與hs-CRP呈正相關（r=0.532,P<0.05）,與SGA呈正相關（r=0.401,P<0.05）,與Alb呈負相關（r=-0.492,P<0.05）,與scr無明顯相關性（r=-0.208,p>0.05）。
5、血清hs-CRP水平和PTX3對老年MHD組患者存在營養不良的預測:采用hs-CRP預測老年MHD患者營養不良與SGA評價結果比較差異有統計學意義（P<0.05）,提示檢測hs-crp水平與sga評價效果不同。ptx3預測老年mhd患者存在的營養不良與sga評價結果比較差別無統計學意義（p>0.05）,提示PTX3評價營養不良與SGA方法評價效果一致。
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