手把手教你設計 siRNA
自 1998 年 Fire 和 Mello 首次提出 RNAi(RNA interference，RNA 干擾) 概念以來，越來越多的人開始重視小 RNA 的研究，之后 RNAi 在基因功能的研究中也得到廣泛應用。RNAi 是一種存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，在生物進化過程中能夠抵御病毒感染及防止基因組中由于逆轉(zhuǎn)座子元件擴增引起的不穩(wěn)定。
在 miRNA(microRNA)、siRNA(small interfering RNA) 等小 RNA 的介導下，RNAi 能夠特異性地調(diào)控 mRNA 基因在表觀遺傳學水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的表達。
小干擾 RNA(Small interfering RNA;siRNA) 與靶向特異性的 mRNA 結(jié)合，通過 RNA 介導的沉默復合體 RISC(RNA-induce siliencing complex) 介導 mRNA 的降解。siRNA 長度一般為 21 - 23nt，被 RISC 識別結(jié)合之后，siRNA 發(fā)生解旋。RISC 在 siRNA 的反義鏈指導下，尋找具有同源序列的內(nèi)源性的 mRNA，并在距離 5』端 10 - 11 位堿基之間切割 mRNA，從而導致轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
siRNA 設計原則
RNAi 最終要通過 siRNA 片段與靶基因結(jié)合并使之降解，因此，確保高度同源于靶基因而絕無與其他基因同源的 siRNA 序列，是決定 RNAi 特異性的關鍵所在，也是 siRNA 設計的基本原則。從具有不同沉默效率的 siRNA 序列中篩選出高效的 siRNA 序列，需要經(jīng)過嚴密的設計和不斷的實驗檢驗。下面我們就來看下 siRNA 設計要遵循哪些原則：
1.siRNA 序列在靶基因中的位置
從靶基因起始密碼子 AUG 下游 50～100 個核苷酸開始搜尋理想的 siRNA 序列，越靠近靶基因的 3′端，其基因沉默效果可能越好。
2. siRNA 序列的起始堿基與長度
SiRNA 序列最好為 AA(N n)UU(N 代表任意堿基;n 為堿基數(shù)目，在 19～29 nt 之間)， NA(N n) UU 和 NA(N n) NN 序列也可以。最新研究表明 ，27 nt 或 29 nt 的 siRNA 與 21 nt siRNA 相比 27 nt SiRNA 對靶基因的最大抑制率可在相對低的濃度下得到。
3 .siRNA 3′端突出堿基的選擇
建議用 dTdT 取代 3′端的 2 個堿基突出，增強 siRNA 雙鏈復合體的穩(wěn)定性。
4 .siRNA 序列中 G/ C 含量的選擇
G/C 含量在 30%～52% 的 siRNA 序列，其沉默基因效果較好。
5 .siRNA 中應避免連續(xù)的單一堿基和反向重復序列
因為連續(xù) 2 個以上的 G 和 C 可以降低雙鏈 RNA 的內(nèi)在穩(wěn)定性，從而抑制 RNAi 作用；連續(xù) 3 個以上的 U 和 A 可能終止由 RNA Polymerase III 介導的轉(zhuǎn)錄。siRNA 序列中的重復序列或回文結(jié)構(gòu)可能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在可以降低 siRNA 的有效濃度和沉默效率。
6 .siRNA 雙鏈的內(nèi)在穩(wěn)定性
反義鏈 5端的第一個堿基盡量為 A 或 U;siRNA 正義鏈的 5端第一個堿基盡量為 G 或 C。
7. siRNA 正義鏈的堿基偏愛性
正義鏈的第一位和第十九位堿基為 A; 正義鏈的第十位堿基為 U; 正義鏈的第十三位堿基不為 G; 正義鏈的第十九位堿基不為 G 或 C 時，siRNA 序列具有較高的基因沉默效率。
8 .siRNA 序列的特異性
目前沒有發(fā)現(xiàn) siRNA 的干擾效率與 mRNA 中具體位置的關系，為確保對靶 mRNA 的有效抑制，針對每一個靶基因結(jié)合上述 siRNA 設計原則選擇靶點相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 條序列。
siRNA 設計步驟
首先在 NCBI 上找到靶基因的目的片段，如果靶基因有多個轉(zhuǎn)錄本就需要把所有 NM 號所對應的 CDS 序列放在 clone Manager 中比對，并選擇擁有序列 CCDS 進行設計。
目前沒有發(fā)現(xiàn) siRNA 的干擾效率與 mRNA 中具體位置的關系，為確保對靶 mRNA 的有效抑制，針對每一個靶基因結(jié)合上述 siRNA 設計原則選擇靶點相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 條序列。隨后將 siRNA 片段進行 Blast 分析，盡量選擇與靶基因特異結(jié)合的序列，進行化學合成后，通過實驗篩選出沉默效率最高的 siRNA 序列進行下一步的基因功能研究。
PS: 需要注意的是，有的 siRNA 序列在設計時沒有遵守這些指導方針，實驗證明也具有很高的干擾效應，這表明，我們只能根據(jù)上述指導方針設計出理論上具有較高沉默效應的 siRNA 序列，siRNA 的最終活性需要用實驗來驗證 。
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