植物細胞培養(yǎng)技術

植物細胞培養(yǎng)技術就是為了某種目的而在細胞水平上對離體植物細胞或原生質(zhì)體進行的一系列生物工藝學操作。它包括分離、培養(yǎng)、再生以及一系列相關的操作。就有用化合物的生產(chǎn)來說，它主要是指在無菌條件下通過懸浮培養(yǎng)植物細胞生產(chǎn)有用化合物的過程。

理論與技術基礎：植物細胞全能性、微生物液體深層發(fā)酵系統(tǒng)、遺傳工程

意義：

1）不受地理、季節(jié)和氣候條件的限制；

2）節(jié)省土地，降低成本，生產(chǎn)周期短，可大大提高經(jīng)濟效益；

3）可代替整體植株在工廠內(nèi)連續(xù)生產(chǎn)所需產(chǎn)物；

4）可通過添加抑制劑等使生物合成按照人的意志進行；

5）可通過誘變篩選，獲得高產(chǎn)細胞株，并且可以進行特定的生物轉(zhuǎn)化獲得新的有用物質(zhì)。

1. 發(fā)展與成果例證

1959年Tu1ecke和Nickell首次采用大體積〔20升〕的硫酸瓶進行了薔薇(Rosa sp．)莖段的細胞大量培養(yǎng)。

1967年Kaul和Staba采用多升發(fā)酵罐對小阿米(Ammi visnaga)進行了細胞大量培養(yǎng)的研究，并從細胞培養(yǎng)物中得到了第一個藥用成分呋喃色酮(visnagin)。

1972年，Kato培養(yǎng)煙草細胞以獲得尼古丁，最后放大到在20000升的生物反應器上進行分批和連續(xù)培養(yǎng)，其生產(chǎn)能力為5．82kg／m3．d。

1983年，***三井石油化學工業(yè)公司利用大規(guī)模培養(yǎng)紫草細胞生產(chǎn)紫草寧，產(chǎn)物終濃度達1400mg／L；隨后，Ushiyama等在20000升生物反應器中成功地進行了100公斤／月的人參愈傷組織培養(yǎng)。

迄今為止，全世界已對近1000余種植物進行過細胞培養(yǎng)方面的研究，生產(chǎn)的天然產(chǎn)物包括藥品、香料、色素、食品、化妝品等500多種。許多植物的細胞培養(yǎng)已完成實驗室階段研究，正向工廠中試過渡，有的已完成工廠化生產(chǎn)規(guī)模的實驗。如人參、紫草、毛地黃、煙草、肉桂、迷迭香、黃芪等。

2. 培養(yǎng)基組成

培養(yǎng)基的組成對植物細胞的生長和代謝物質(zhì)的生產(chǎn)影響極大。典型的培養(yǎng)基有Murashige-Skoog(MS),Linsmaier-Skoog(LS)，white和B5等四種。

無機鹽類：在無機鹽中，磷酸根及氮源(NH4+或N03-)的含量對細胞的生長與物質(zhì)生產(chǎn)有明顯的影響。另外，一些金屬離子如Ca2+、Cu2+、 Mg2+等的含量往往也有重要影響。---碳源：通常使用2―3％的蔗糖作碳源，也有使用葡萄糖或果糖。使用單糖的優(yōu)點是方便分析測定，且有助于細胞生長動力學分析。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物細胞的生長和代謝物質(zhì)生產(chǎn)的影響十分大。它可分為兩大類：植物生長素類有2，4―D(二氯苯氧基乙酸)、IAA(吲哚基醋酸)、NAA(萘乙酸)等，細胞激動素類有BA(芐基腺凜吟)、動力精和玉米素。

其他因素：植物細胞培養(yǎng)的影響因素還有培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)氣相組成(CO2和乙烯含量)、前體物質(zhì)、氨基酸、維生素及誘導劑等。

3. 培養(yǎng)條件

溫度：培養(yǎng)溫度對植物細胞生長及二次代謝產(chǎn)物生成有重要影響。通常，植物細胞培養(yǎng)采用25℃。

攪拌：在搖瓶實驗中，通常搖床的轉(zhuǎn)速取90―120r／min。

pH值：通過細胞膜進行的H+離子傳遞對細胞的生育環(huán)境、生理活性來說無疑是重要的。在培養(yǎng)過程中，通常pH作為一個重要參數(shù)被控制在一定范圍內(nèi)。植物細胞培養(yǎng)的適宜pH值一般為5―6。

通氣：通氣是細胞液體深層培養(yǎng)重要的物理化學因子。好氣培養(yǎng)系統(tǒng)的通氣與混合及攪拌是相互關聯(lián)的。對搖瓶試驗，通常500m1的三角瓶內(nèi)裝80―200m1的植物細胞培養(yǎng)液較適宜。當然，氣液傳質(zhì)還與瓶塞的材料有關。試驗表明，從溶氧速率考慮，以棉花塞最好，微孔硅橡膠塞次之，鋁箔塞最差。

光：光對植物有著特殊的作用。光照射條件不僅通過光照周期、光的質(zhì)量(即種類、波長)而且通過光照量(光強度)的調(diào)節(jié)來影響植物細胞的生理特性和培養(yǎng)特性。研究表明，光調(diào)節(jié)著細胞中的關鍵酶的活性，有時光能大大促進代謝產(chǎn)物的生成，有時卻起著阻害作用。

細胞齡：在培養(yǎng)過程的不同時期，細胞的生理狀況、生長與物質(zhì)生產(chǎn)能力差異顯著。而且，使用不同細胞齡的種細胞，其后代的生長與物質(zhì)生產(chǎn)狀況也會大不一樣。通常，使用處于對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期前期的細胞作為接種細胞較合適。

接種量：在植物細胞培養(yǎng)中，接種量也是一個影響因素。在再次培養(yǎng)中，往往取前次培養(yǎng)液的5―20％作為種液，也以接種細胞濕重為基準，其接種濃度為15―50g(濕細胞)／L。由于接種量對細胞產(chǎn)率及二次代謝物質(zhì)的生產(chǎn)有一定影響，故應根據(jù)不同的培養(yǎng)對象通過試驗，確定其最大接種量。

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