PriCells: 正常小鼠腹股溝脂肪墊獲取脂肪源干細胞

實驗材料：

1. Hank’s緩沖鹽溶液（HBSS）；

2. ASC培養基：含10%胎牛血清的DMEM，添加1%的P/S；

3. 膠原酶溶液：100ml Hank’s緩沖鹽溶液中加入1g牛血清白蛋白和0.1gⅡ型膠原酶；

4. 聚乙烯吡咯酮碘溶液；

5. 陪替氏培養皿，9cm；離心管，50ml；組織培養瓶，25cm2；

6. 剪刀（2把），鑷子（2把）；

7. PBSA；

8. 小鼠，4—6只；

9. 麻醉劑：三溴乙醇；

實驗方法：

1. 37℃水浴中預熱HBSS和脂肪源干細胞培養基；

2. 麻醉動物后處死；

3. 轉移動物至層流凈化罩中；

4. 70%酒精消毒腹部；

5. 采用低位橫向切口打開腹腔；

6. 用鑷子取出性腺/附睪和腹股溝處的脂肪墊；

7. 將脂肪組織置于培養皿中，加入HBSS；

8. 待所有動物脂肪取出后，將脂肪轉移至新的培養皿中；

9. 加入含有5%聚乙烯吡咯烷碘酮的HBSS 2—3min；

10. 漂洗組織并用HBSS洗滌脂肪；

11. 用無菌鑷子將脂肪轉移至50ml離心管中；

12. 用無菌剪刀將脂肪切碎；

13. 加入與組織體積相同的膠原酶溶液并混勻；

14. 將離心管置于37℃水浴中60min，其間不時混勻一下；

15. 離心，50—100g，5min；

16. 取出離心管，用力搖晃（將基質細胞與原代脂肪細胞完全分離），再次離心5min；

17. 小心吸去上層油脂，油脂層中含有原代脂肪細胞，注意不要破壞位于下方的基質—血管細胞層；

18. 加入5—10ml PBSA，重懸沉淀，再次離心5min；

19. 洗滌三次，注意不要吸走基質—血管細胞層；

20. 最后一次洗滌后，加入8ml ASC培養基重懸沉淀，轉移至T25培養瓶中，置于37℃，5%CO2溫箱中；

21. 待細胞貼壁生長2—4天后換液；

22. 換液時通過棄去培養基，從而去除未貼壁的細胞；

23. 以后每周更換培養基2次；

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