從單個(gè)核細(xì)胞中分離T細(xì)胞

一、用玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)分離E＋細(xì)胞

1．制備AET-綿羊紅細(xì)胞

1）在刻度離心管中，用無菌的含5％小牛血清的Hanks液洗滌綿羊紅細(xì)胞3次，每次離心500×g 10分鐘。

2）吸凈上清液，測量紅細(xì)胞比容。輕擊試管分散紅細(xì)胞，加入4倍紅細(xì)胞比容量、新鮮制備的AET溶液，混勻。室溫中反應(yīng)30分鐘。

3）用無菌的含5％小牛血清的Hanks液洗滌AET-綿羊紅細(xì)胞5次，每次離心500×g，10分鐘。用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮至10％（v/v）濃度。10％ AET-綿羊紅細(xì)胞懸液可在4℃保存三周。

2．用玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)分離E＋細(xì)胞（Ficoll分離法）

1）用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將單個(gè)核細(xì)胞懸浮至107/ml，加入1/10~1/20量的10％ AET-綿羊紅細(xì)胞懸液。混合后，室溫放置1小時(shí)。離心500×g 10分鐘，4℃過夜。

2）吸去上清液，用手輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，使細(xì)胞懸浮，不要用吸管吹打。加入同樣培養(yǎng)液至原容量。

3）將細(xì)胞懸液小心加在半量淋巴細(xì)胞分離液上，室溫中水平離心500×g 20分鐘。

4）吸棄上層無細(xì)胞液體，將細(xì)胞培養(yǎng)液和淋巴細(xì)胞分離液交界面的細(xì)胞和約85％的淋巴細(xì)胞分離液吸出，置另一離心管中。交界面的即E－細(xì)胞，立即向該細(xì)胞懸液中加等量洗滌液，離心500×g 10分鐘，去上清液；再用洗滌液同樣洗滌2次，除去淋巴細(xì)胞分離液，以備進(jìn)一步分離B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。

5）分離E＋細(xì)胞：吸出剩余液體，用10倍量Gey’s液懸浮沉淀細(xì)胞1～2分鐘，低滲溶解紅細(xì)胞。立即加入同量兩倍濃縮的PBS，恢復(fù)等滲。離心500×g 10分鐘，去上清液。再用RPMI-1640培養(yǎng)液同樣洗滌2次。此即E＋細(xì)胞。用1％臺(tái)盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮至適當(dāng)濃度。

3．用玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)分離E＋細(xì)胞（Percoll分離法）

制備Percoll密度梯度

1）將1份10倍濃縮的PBS與9份Percoll混合，得到等滲的Percoll溶液，比重應(yīng)是1.127。

2）稀釋液（含25mmol/L Hepes, 10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液）的比重約1.008左右。按下式配制不同比重的Percoll溶液： ％ Percoll＝（所需比重－稀釋液比重）/（等滲Percoll溶液比重－稀釋液比重）×100

分離E＋細(xì)胞

1）取10ml 5×106/ml的單個(gè)核細(xì)胞置離心管中，加2.5ml 10％ AET-綿羊紅細(xì)胞和1ml小牛血清，混合后，20℃離心200×g 15分鐘，確定沒有懸浮的紅細(xì)胞，冰浴60分鐘或過夜。

2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，使細(xì)胞懸浮。注意不要用吸管吹打，吹打會(huì)打散一些玫瑰花結(jié)。將細(xì)胞懸液小心加在7～8ml Percoll溶液上，室溫中水平離心500×g 20分鐘。

3）吸棄上層無細(xì)胞液體，將交界面的細(xì)胞和約85％的Percoll溶液吸出，置另一離心管中。此即E－細(xì)胞，應(yīng)立即用RPMI-1640培養(yǎng)液洗去Percoll。

4）收集E＋細(xì)胞：盡量吸棄紅細(xì)胞上的Percoll溶液，用5ml Gey’s液懸浮細(xì)胞1～2分鐘，溶解紅細(xì)胞。立即將加入同量兩倍濃縮的PBS，恢復(fù)等滲，離心500×g 10分鐘，去上清液。再用RPMI-1640培養(yǎng)液同樣洗滌2此。

5）分別用RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮E＋和E－細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞。用熒光標(biāo)記的抗體測定制劑中的B細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比。

二、用尼龍毛分析T細(xì)胞

尼龍毛柱的制備（注意無菌操作）

1.取直徑3D，長度約10cm的尼龍毛，用0.2mol/L HCl浸泡處理過夜。用雙蒸水洗凈HCl，置37℃烘干備用。

2.稱取50mg尼龍毛，均勻分散后置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約5～6cm。此柱可分離約2×107細(xì)胞。將柱置－20℃可保存2～3個(gè)月。

分離細(xì)胞

1.取PBMC，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2×107/0.5ml。

2.融化凍存的尼龍毛柱，以每分鐘5～7滴的速度放出Hanks液。用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。將0.5ml上述PBMC懸液加入尼龍毛柱中，待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍毛柱后，立即加0.2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管。

3.在37℃ 5％ CO2飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞與尼龍毛充分粘附。用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫尼龍毛柱。洗脫液中含有純的T細(xì)胞。1000×g離心洗脫液10分鐘，去上清液。再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次。計(jì)數(shù)細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。

三、用免疫磁珠法分離T細(xì)胞

將特異性抗T細(xì)胞單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠（immunomangnetic beads），用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合T細(xì)胞。在磁場中，結(jié)合T細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的B細(xì)胞和其它細(xì)胞被洗脫下來。再從免疫磁珠上洗脫T細(xì)胞。

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