細胞培養(yǎng)的一般技術
促細胞分裂劑激活單核細胞
基本原理 ：
本方法是通過促細胞分裂劑與細胞表面受體相互作用，在體外觸發(fā)細胞的多克隆激活。根據(jù)所使用的促細胞分裂劑的不同，應答細胞可以是T淋巴細胞、B淋巴細胞，或兩者同時，或者是單核細胞。 細胞激活可以通過細胞增殖、細胞因子分泌、表面抗原表達和/或細胞體積的增加進行檢測。例如在使用B細胞激活劑時，可以通過多克隆免疫球蛋白的分泌進行檢測。
表1 常用的促細胞分裂劑和多克隆淋巴細胞激活劑
促細胞分裂劑 所 用 濃 度 應 答 細 胞
刀豆蛋白AConA 1- 10 μg/ml T 淋巴細胞
植物凝集素PHA 1-5 μg/ml T 淋巴細胞
佛波醇酯PMA 1-10 ng/ml T 淋巴細胞
婁諾霉素+PMA 100-500 ng/ml T 淋巴細胞
脂多糖LPS 2-25 μg/ml 鼠B細胞（T不依賴型），單核細胞
美洲商陸PWN 試驗測定 人B細胞（T依賴型）
葡萄球菌A，SAC 1/1000-1/10000 人B細胞
試劑和設備：
細胞懸浮液；
96孔平底組織培養(yǎng)板；
含血清培養(yǎng)基（通常為 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）；
促細胞分裂劑（見表1），要求純品或半純品，有市售商品；
多通道移液器和微量移液器；
帶570nm濾片的酶標儀；
超凈工作臺；
CO2孵箱；
冷凍離心機。
操作步驟：
（一）促細胞分裂劑制備
根據(jù)說明書將促細胞分裂劑重新溶解于水或培養(yǎng)液中，制成儲存液（如100′），保存于-20℃。
（二）促細胞分裂劑滴定
1、在培養(yǎng)液中稀釋儲存液到所需的第一個濃度，通常為理論最佳濃度的10倍；
2、在培養(yǎng)板或試管中直接將促細胞分裂劑進行濃度遞減系列稀釋（100 μl/孔）；
3、每孔平行重復三次；
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