細胞試驗基本方法

單核細胞的分離

基本原理

本文分離單核細胞所用方法是Percoll非連續性密度梯度離心法，主要是根據不同細胞間密度的差別進行細胞分離。此法易操作，且使用通常的實驗設備即可完成。

試劑與器材

·外周血單個核細胞（參見實驗1）
　　·PBS1×和PBS10×（無Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA
　　·胎牛血清（56℃，30分鐘加熱滅活）
　　·HCl1mol/l
　　·Percoll分層液（密度=1.130g/ml,商品）
　　·4g/l臺盼藍染液（溶解在PBS液中）
　　·50ml聚丙烯圓錐管
　　·毛細吸管
　　·移液管（1、2、10ml）
　　·CO2孵箱
　　·超凈臺
　　·有旋轉桶轉子裝置的離心機
　　·PH計

操作步驟

所有的操作應該在無菌條件下進行

（一）不同密度Percoll分層液的配制

1.Percoll分層液儲備液的制備：取未稀釋的Percoll原液（從瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（無Ca2+、Mg2+），用HCl1PH至7.4

2. Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll儲備液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（無Ca2+、 Mg2+）

3. Percoll分層液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

4. Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

（二）不連續密度梯度制備

1. 將洗滌過的8×107外周血單個核細胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在這層液體的表面上輕輕鋪上2ml Percoll分層液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）

2. 20℃，在旋轉轉子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘（慢慢增加速度，無制動停轉）。

（三）單核細胞的分離

1. 離心后單核細胞存在于Percoll分層液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度較小的部分）之間的界面中。

2. 用毛細吸管仔細收集單核細胞。

3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗滌細胞3次，4℃，400×g離心5分鐘，棄上清液。

4. 若需要進一步實驗，將細胞重新懸浮于培養基中。

5. 用臺盼藍拒染法測定細胞存活率。

結果：本法回收的細胞中單核細胞占70-100%（存活率應大于90%），淋巴細胞占0-20%，粒細胞占0-5%，紅細胞占0-7%，血小板小于0.5%。

實驗要點

1.為了得到較好的結果，外周血單個核細胞分離后應立即使用。

2.所有操作過程應在18-20℃中進行。

3.仔細覆蓋各種Percoll分層液，避免破壞其界面。

4.洗滌分離細胞3次，以除去殘存的Percoll分層液和血小板。

5.如果所制備的細胞仍不純，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗體分子的磁珠， 以除去殘存的NK、T、B淋巴細胞。

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