正常大鼠皮膚肥大細(xì)胞的培養(yǎng)

實驗材料：

1. 正常大鼠（體重150g—250g）的皮膚；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 消化液：1g/L膠原酶和1g/L透明質(zhì)酸酶（1 : 1， v/v ）混合消化液，用含10mmol/L HEPES和20%FBS的HBSS配制；

4. 沖洗液：改良的Tyrode液，含137mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4、5.55 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L CaCl2 和1 mmol/L MgCl2 ；

5. 培養(yǎng)液：ROMI1640，添加10%FBS、25 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、100000 IU/L青霉素和100mg/L慶大霉素。pH7.2；

6. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷，止血鉗；

7. 離心管（15ml、50ml）

8. 網(wǎng)篩：0.75mm不銹鋼濾網(wǎng)

實驗方法：

1. 乙醚麻醉后，放血處死動物。剃去腹部毛，用70%乙醇消毒。切開皮膚，剝?nèi)〖s3cm×4cm皮片。將皮片放入培養(yǎng)皿內(nèi)，用沖洗液清洗3次；

2. 用刀片將皮片垂直切成約1mm2 小片，放入三角瓶中，然后加入20—25ml消化液，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜止消化4h。將三角瓶移入恒溫水浴振蕩器內(nèi)，37℃水浴中振蕩消化45min；

3. 用吸管充分吹打組織塊，再用孔徑為0.75mm的不銹鋼濾網(wǎng)濾出組織塊。收集濾液，在4℃條件下離心（150g，5min）。吸去上清液，用預(yù)冷的沖洗液混懸沉淀細(xì)胞，離心（150g，5min）。用培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，使混合細(xì)胞中肥大細(xì)胞達(dá)到2×105 個/ml。培養(yǎng)12h；

4. 輕輕搖晃培養(yǎng)皿，收集含有肥大細(xì)胞的培養(yǎng)液。然后，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)皿中置于37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)；

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